L—環(huán)己基甘氨酸工業(yè)品中L—苯甘氨酸的HPLC測(cè)定

摘要：建立一種測(cè)定L-環(huán)己基甘氨酸工業(yè)品中L-苯甘氨酸含量的高效液相色譜（HPLC）法。色譜柱為Agela InnovalC18（250mmx4.6mmx5μm），采用乙腈-20mmol/L磷酸二氫鉀溶液（v：v=8：92）為流動(dòng)相（pH 5.0）。L-苯甘氨酸在質(zhì)量濃度為1.25xlO-4-0.5mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.9987。實(shí)際樣品中L-苯甘氨酸日內(nèi)和日間測(cè)定精密度分別為1.2%和2.7%，回收率為102.7%。所建立的HPLC方法能夠很好地提供L-環(huán)己基甘氨酸樣品中相關(guān)雜質(zhì)L-苯甘氨酸的含量信息，并可反映出L-環(huán)己基甘氨酸的原料轉(zhuǎn)化率，從而有效地指導(dǎo)其生產(chǎn)工藝的控制。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜（HPLC）；L-苯甘氨酸；L-環(huán)己基甘氨酸；生產(chǎn)工藝控制

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-5124（2015）02-0046-04

引 言

環(huán)己基甘氨酸是一種非天然氨基酸，廣泛用于藥學(xué)以及肽化學(xué)研究，是生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品B-內(nèi)從事色譜分離和分析工作。

酰氨類抗生素、合成多肽激素以及農(nóng)藥的重要中間體。由于它用途廣泛，在醫(yī)藥市場(chǎng)前景廣闊。

Adriaan等報(bào)道了L-環(huán)己基甘氨酸的工業(yè)合成方法，L-苯甘氨酸作為原料，以Rh/C為催化劑，通入氫氣進(jìn)行還原，得到L-環(huán)己基甘氨酸。L-苯甘氨酸加氫還原的催化劑還有Pd（OH）2/C和Pt02等。該方法原料易得，合成路線簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。從合成路徑（見(jiàn)圖1）可看出，L-苯甘氨酸是L-環(huán)己基甘氨酸中的主要雜質(zhì)。由于兩者結(jié)構(gòu)相似，它們?cè)诜磻?yīng)上也具有相似性，所以，當(dāng)L-環(huán)己基甘氨酸作為原料生產(chǎn)下游產(chǎn)品時(shí)，殘留的L-苯甘氨酸將發(fā)生與之類似的反應(yīng)，引入難以分離的副產(chǎn)物，嚴(yán)重影響下游產(chǎn)品質(zhì)量，因此必須嚴(yán)格控制。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)L-苯甘氨酸測(cè)定的報(bào)道主要集中在手性拆分和純度檢驗(yàn)方面，包括高效液相色譜法、液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、差減光度法和電致化學(xué)發(fā)光一分子印跡法等。然而，對(duì)于L-苯甘氨酸作為雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定的方法，國(guó)內(nèi)外暫未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。因此，實(shí)驗(yàn)建立了對(duì)L-環(huán)己基甘氨酸工業(yè)品中L-苯甘氨酸進(jìn)行快速測(cè)定的高效液相色譜法。

1.實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Waters Alliance 2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Wal.ers公司），配有真空脫氣機(jī)、四元梯度泵、120位自動(dòng)進(jìn)樣器、智能型柱溫箱、996型二極管陣列（PDA）檢測(cè)器和Waters Empower色譜管理系統(tǒng)。

甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)Honeywell公司）；磷酸二氫鉀為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)中所用水均為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品為分析純（99%），購(gòu)自上海誠(chéng)凜生物公司。

1.2色譜條件

色譜柱：Agela Innoval C18柱（250mmx4.6mmX5μm）（天津艾杰爾科技有限公司）；柱溫為30℃；流動(dòng)相：乙腈一磷酸二氫鉀溶液（20 mmol/L，pH5.0），8∶92（v∶v）；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品lO.OOmg，置于lOmL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，配得1.000 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋至0.5，0.3，0.1，0.05，0.01，0.005， 0.001， 0.0005，1.25x10-4，3.75xlO-smg/mL。

1.3.2 樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取L-環(huán)己基甘氨酸樣品約10.00mg置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，然后超聲20min。樣品溶液冷卻至室溫后，經(jīng)0.45μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)HPLC柱分析。

2.結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用二極管陣列檢測(cè)器在200～400nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描，L-苯甘氨酸的特征紫外吸收波長(zhǎng)為260nm和210nm，其中，260nm處的吸收明顯弱于210nm（見(jiàn)圖2）。考慮到L-苯甘氨酸為L(zhǎng)-環(huán)己基甘氨酸樣品中的殘留，含量不會(huì)很高，為提高檢測(cè)靈敏度、降低檢出限，選擇210nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

由于檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，甲醇的截止波長(zhǎng)為205nm，乙腈的截止波長(zhǎng)為190nm，因此選用乙腈作為有機(jī)調(diào)節(jié)劑，避免流動(dòng)相吸收引起的干擾。

L-苯甘氨酸和L-環(huán)己基甘氨酸都是兩性化合物，在中性含水流動(dòng)相中會(huì)部分解離，為防止峰形畸變，保證各被測(cè)物質(zhì)得到足夠的色譜保留，在流動(dòng)相中加入磷酸二氫鉀作為離子抑制劑。實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈比例和磷酸二氫鉀溶液的pH值對(duì)分離的影響。

1）有機(jī)調(diào)節(jié)劑比例的影響

固定流動(dòng)相中磷酸二氫鉀水溶液的摩爾濃度為20mmol/L.當(dāng)乙腈的體積分?jǐn)?shù)由5%變化到10%時(shí)，分析物L(fēng)-苯甘氨酸以及未知雜質(zhì)I的保留時(shí)間均有所縮短（見(jiàn)圖3），說(shuō)明乙腈比例對(duì)L-苯甘氨酸及相關(guān)雜質(zhì)的保留行為均有影響，改變乙腈比例可以有效地調(diào)節(jié)分離時(shí)間和各物質(zhì)的分離情況。綜合考慮分離的效果和時(shí)間，選擇流動(dòng)相中乙腈的比例為8%。

2）磷酸二氫鉀溶液pH的影響

固定流動(dòng)相中乙腈的比例為8%，考察20mmol/L磷酸二氫鉀水溶液pH值變化對(duì)分析物保留行為的影響（見(jiàn)圖4）。隨磷酸二氫鉀水溶液pH值的增大，分析物的保留時(shí)間逐漸縮短，但是并不顯著，峰形也無(wú)明顯變化，說(shuō)明磷酸二氫鉀溶液的pH值對(duì)檢測(cè)無(wú)明顯影響。考慮到保護(hù)色譜柱的壽命，流動(dòng)相pH值不應(yīng)過(guò)高或者過(guò)低，因此選擇pH5.0為最終pH值。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在1.2色譜條件下，L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和L環(huán)己基氨酸樣品溶液的色譜圖如圖5所示。各質(zhì)量濃度的L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣兩次。其中質(zhì)量濃度為0.05mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.85%。以峰面積4對(duì)質(zhì)量濃度c作圖，如圖6所示，L-苯甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在1.25xlO-4～0.5mg/mL范圍內(nèi)成線性，線性回歸方程為A=l.97xl07c+70018，相關(guān)系數(shù)r2=0.9987，當(dāng)S/N=3時(shí)，檢出限為3.75xl0-5mg/mL。

2.3 回收率測(cè)定

精確稱取3份L-環(huán)己基甘氨酸樣品分別置于3只10mL容量瓶中，向其中分別添加已知量的不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按流動(dòng)相比例稀釋至刻度，在建立的色譜條件下進(jìn)行回收率的測(cè)定。L-苯甘氨酸的回收率為102.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 1-環(huán)己基甘氨酸工業(yè)品中L-苯甘氨酸質(zhì)量分

數(shù)的測(cè)定

平行配制3份樣品溶液，每份溶液進(jìn)樣2次，進(jìn)行日內(nèi)含量的測(cè)定。同法每隔一天配制一份樣品溶液，連續(xù)3天，進(jìn)行日間含量的測(cè)定。樣品色譜圖如圖5中曲線b所示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果如表2所示。

3.結(jié)束語(yǔ)

本文建立了測(cè)定L-環(huán)己基甘氨酸工業(yè)品中L-苯甘氨酸含量的HPLC方法，成功地實(shí)現(xiàn)了L-苯甘氨酸與其他雜質(zhì)的分離與定量。實(shí)驗(yàn)采用AgelaInnoval C18色譜柱，以乙腈-20mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 5.0），8：92（v：v）等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。本方法不僅操作簡(jiǎn)便，而且測(cè)定快速，準(zhǔn)確可靠，可用于L-環(huán)己基甘氨酸工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品檢驗(yàn)和中間控制。