量子點多重染色在卵巢癌體外成像的應用

量子點多重染色在卵巢癌體外成像的應用

葉稱連1傅芬1聶麗菊1陳進聰許恒毅

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330006)

摘要〔〕目的利用量子點(QDs)免疫熒光技術對卵巢癌SKOV3細胞上葉酸受體(FR)及人附睪蛋白(HE)4進行定位，初步揭示QDs多重染色在卵巢癌細胞體外成像的應用價值。方法采用活潑酯法，構建不同發射波長的QDs-鏈霉親和素(SA)復合物，分別與生物素化-葉酸(FA)及生物素化-抗HE4抗體結合，形成特異性熒光探針，同時靶向結合SKOV3細胞，實現細胞雙重染色。結果構建的QD-FA及QD-抗HE4抗體靶向探針具有極強的特異性，量子點多重染色的熒光強度與單重染色相比差異無統計學意義(P>0.05)。量子點具有極強的光學穩定性。結論量子點多重染色在卵巢癌細胞體外成像中具有一定的應用價值，可為卵巢癌早期檢測提供一種新思路。

關鍵詞〔〕量子點；多重染色；卵巢癌；體外成像

中圖分類號〔〕R737.3〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學

通訊作者：許恒毅(1981-)，男，副教授，主要從事毒理學研究。

1南昌大學第二附屬醫院

第一作者：葉稱連(1987-)，女，碩士，主要從事婦科腫瘤研究。

The application of multiplexed quantum dots staining in ovarian cancer imaging in vitro

YE Chen-Lian, FU Fen, NIE Li-Ju,etal.

State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047,Jiangxi, China

Abstract【】ObjectiveTo detect the folate receptor (FR) and human epididymis protein 4 (HE4) receptor localization in ovarian cancer SKOV3 cells simultaneously by quantum dots (QDs) immunofluorescence technique, and validate the application value of multiplexed QDs staining.MethodsThe streptavidin (SA)-QDs compounds with different emission wavelength was established by active ester method. These compounds could be coupled with biotinylated folate and biotinylated anti-HE4 antibody, forming specific fluorescent probes to target bind SKOV3 cells simultaneously, to realize cells double staining.Results(1) The QD-FA and QD-HE4 target probes had strong specificity. (2) There was no significant difference in fluorescence intensity between QDs multiple staining and single staining. (3) QDs had strong optical stability.ConclusionsMultiplexed QDs staining has its application value in ovarian cancer in vitro imaging and could be a new thinking in ovarian cancer early detection.

【Key words】Quantum dots; Multiplexed staining; Ovarian cancer; Imaging in vitro

量子點(QDs)是近年發展起來的一種新型納米發光粒子，相對于傳統染料，它具有熒光強度高、熒光壽命長、抗光漂白能力強、激發波譜寬、發射波譜窄及可同時激發多重熒光等獨特的光學特性。這些特性使其可作為一種新型標記物應用于腫瘤的分子病理及體外成像診斷。QDs的體外成像最初是通過QDs單重染色來實現的，近年來，有多項研究表明QDs多重染色相對于單重染色在腫瘤細胞及組織體外成像上具有優越性〔1，2〕。本文針對卵巢癌細胞SKOV3表達的葉酸受體(FR)和人附睪蛋白(HE)4，構建生物素-鏈霉親和素系統(BAS)介導的QD-葉酸(FA)及QD-抗HE4抗體靶向探針，同時靶向結合SKOV3細胞，實現量子點多重染色在細胞體外成像的應用，為卵巢癌的早期檢測提供新思路。

1材料及方法

1.1主要試劑、材料與儀器水溶性QSH550及QSH620(Ocean NanoTech公司，羧基功能化)，生物素氨己基-N-羥基丁二酰亞胺活性酯、鏈霉親和素(SA)(華藍化學公司)，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(南京森貝伽生物科技有限公司)，1-乙基-3-〔3-二甲基氨基丙基〕碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N，N-二環己基碳二亞胺(DCC)(美國Sigma-Aldrich公司)，生物素化-FA(本實驗室前期合成)，HE4羊多克隆抗體(SANTA CRUZ生物公司)，FITC-兔抗羊IgG(EARTH生物公司)，其他試劑均為分析純；卵巢癌SKOV3細胞及肺癌A549細胞由江西省南昌大學第一附屬醫院實驗中心饋贈；倒置熒光顯微鏡(Nikon公司)，96孔細胞培養板(BOYANG公司)，直熱式CO2培養箱(Thermo scientific公司)等。

1.2實驗方法

1.2.1QD-SA的合成分別取適量QSH620及QSH550(濃度分別為8 μmol/L及8.3 μmol/L)溶于pH5.5的硼酸鹽緩沖液中(BB)，采用活潑酯法，按照QD：EDC/NHS摩爾比1∶500加入EDC/NHS，室溫反應5～10 min。調整溶液pH到8～8.5，按摩爾比40∶1加入SA，持續混勻2 h后，加入10 μl含5%BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)，封閉10 min終止反應。耦聯的QD-SA復合物10 000 r/min下離心5 min除去少量沉淀，用pH7的BB在100 K超濾管中洗滌(10倍體積交換)，最后重懸于0.1 ml pH7的BB中。

1.2.2生物素化HE4的合成取HE4山羊多克隆抗體(濃度為200 μg/ml) 20 μl溶于400 μl pH7.4的1倍PBS溶液中，按生物素∶抗體摩爾比40∶1加入長鏈生物素5.6 μg，混勻，室溫反應4 h，將最終反應的混合溶液置于4℃1×PBS溶液中透析3 d，4℃保存備用。

1.2.3QDs單重染色在卵巢癌SKOV3細胞體外成像的應用獲取對數生長期的卵巢癌SKOV3細胞及肺癌A549細胞種植于96孔板中，細胞數約1×104/孔，于37℃、5%CO2培養箱內孵育24 h。1倍PBS沖洗3次，采用4%甲醛在常溫下固定細胞15 min，立即用含1%牛血清蛋白(BSA)的Tris緩沖液(TBS-BSA)沖洗3次，用含0.1%吐溫-20的TBS滲透細胞20 min，TBS-BSA沖洗3次后用TBS/0.1%酪氨酸/5%BSA混合液封閉細胞上的非特異性結合位點1 h。沖洗后分別加入生物素化FA(0.25 mg/ml)或生物素化抗HE4抗體(1∶50)在常溫下共孵育2 h，用TBS-BSA沖洗3次(每次5 min)，分別加入50 nmol/L的QD550-SA或QD620-SA反應30 min，沖洗3次脫色，用DAPI復染細胞核30 min，沖洗3次后立即在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞成像，每組重復3次。

1.2.4量子點多重染色在卵巢癌SKOV3細胞體外成像的應用量子點多重染色采用循環染色的方法，細胞的前期處理如上所述，經過固定、滲透后，細胞先與生物素化FA共孵育2 h，TBS-BSA沖洗3次后，加入50 nmol/L QD550-SA反應30 min，沖洗3次脫色，作為第一個循環。從封閉開始進行第二個循環，使用TBS/0.1%酪氨酸/5%BSA混合液沖洗2次(5 min/次)，再封閉1 h，加入生物素化抗HE4抗體反應2 h，使用QD620-SA進行染色，最后用DAPI復染細胞核。為比較量子點染色信號，可通過變換染色順序來作為陽性對照。

1.2.5圖像采集及熒光強度數據分析使用倒置熒光顯微鏡采集所有圖像，采用ImageJ軟件進行分析。選擇每個視野下基于視覺注意機制的感興趣區(包括至少100個細胞)，檢測其熒光強度，然后一個孔內的細胞選擇多個視野及多個感興趣區，求得其平均熒光強度值。應用SPSS17.0軟件，多組樣本均數間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，方差齊性者兩兩比較使用LSD檢驗，方差不齊者則采用DunnetT3檢驗。

2結果

2.1QDs的表征QSH620在常溫下為澄清的紅色溶液，透射電子顯微鏡(TEM)顯示該粒子大小均一，平均為(8.34±3.31)nm，動態光散射分析(DLS)表明其水化粒徑分布較集中，平均為(49.0±0.8)nm，Zeta電位為(-35.99±2.81)mV。QSH550在常溫下為澄清的綠色溶液，TEM顯示該粒子大小均一，平均為(7.38 ±2.58)nm，DLS表明其水化粒徑分布較集中，平均為(31.5±0.6)nm，Zeta電位為(-33.36±4.51)mV。

2.2量子點單重染色在卵巢癌SKOV3細胞體外成像的應用量子點對SKOV3細胞特異性抗體進行單重染色，QD550-FA靶向結合細胞膜表面，QD550-抗HE4抗體靶向結合于細胞質內，而FR表達于陰性的A549細胞，QD550-FA在細胞內未見明顯熒光(圖1A)，對照組不加抗體，QDs染色后只有細胞核DAPI顯示的藍色，證實了量子點-抗體復合物的特異性。同樣，采用QD620-FA及QD620-抗HE4抗體對SKOV3染色，其結果同上(圖1B)，而使用QD620-抗HE4抗體對A549進行染色，可見其細胞質內呈現稍弱的紅色熒光，推測HE4在A549細胞上有表達，但其表達量較少。QD550-FA在SKOV3細胞上的熒光強度可達(41.25±5.25)，而使用相同濃度的QD550-FA染色A549的熒光強度值僅為(3.57±0.02)，兩者差異有統計學意義(P<0.01)，判定A549細胞為非特異性染色效果。QD550-抗HE4抗體染色SKOV3細胞的熒光強度值為(42.87±5.75)，稍高于QD550-FA的熒光強度值，推測SKOV3細胞上的HE4表達稍高于FR，但都顯著高于對照組(3.55±0.10)(P<0.01)。QD620-FA對SKOV3細胞染色的熒光強度為(30.20±5.52)，而QD620-抗HE4抗體的熒光強度為(31.88±5.12)，明顯高于QD620-抗HE4抗體對A549細胞染色的熒光強度(12.36±2.80)(P<0.01)。

(A)分別為QD550-FA組、QD550的control組及QD550-抗HE4抗體組對SKOV3細胞的單重染色圖，最后一組為QD550-FA對A549的單重染色圖；(B)分別為QD620-FA組、QD620的control組及QD620-抗HE4抗體對SKOV3細胞的單重染色圖，最后一組為QD620-抗HE4抗體對A549的單重染色圖 圖1　量子點單重染色圖

2.3量子點多重染色在卵巢癌SKOV3細胞體外成像的應用如圖2所示，通過不同顏色QDs標記的特異性探針共同靶向卵巢癌SKOV3細胞，從而達到單個細胞上呈現多重染色的效果。圖2A為20倍鏡下SKOV3細胞膜被QD550-FA(綠色信號)復合物、細胞質被QD620-抗HE4抗體(紅色信號)復合物分別標記后及細胞核同時被DAPI標記的多重染色圖，其中Merged為前三種顏色通道合并后的成像圖。在40倍鏡下可清楚地觀察到細胞質分別被QD620-抗HE4抗體(紅色，圖2B)及QD620-抗HE4抗體(紅色，圖2C)標記，而細胞膜被QD550-FA(綠色，圖2C)及QD620-FA(紅色，圖2B)標記，Merged中可看到三種顏色通道合并后的成像。A549細胞作為對照，使用QD620-FA靶向作用其細胞膜，QD550-抗HE4抗體作用于其細胞質，因其細胞膜上的FA受體表達呈陰性，故FA組未見明顯熒光，而HE4組可見較暗綠色熒光，最終Merged中只可見綠色及細胞核DAPI藍色組像(圖2D)。

QD550-抗HE4抗體對SKOV3染色的熒光強度可達到(41.22±3.10)，QD620-FA的熒光強度為(32.38±4.30)，與單重染色時的熒光強度相比差異無統計學意義(P>0.05)。QD550-FA及QD620-抗HE4抗體對SKOV3染色的熒光強度分別為(36.22±2.81)及(37.30±3.32)，同樣與單重染色時的熒光強度相比差異無統計學意義(P>0.05)。

(A)20倍鏡下QD620-抗HE4抗體及QD550-FA對SKOV3細胞的多重染色結果；(B)40倍鏡下QD550-抗HE4抗體及QD620-FA對SKOV3細胞的多重染色結果；(C)40倍鏡下QD620-抗HE4抗體及QD550-FA對SKOV3細胞的多重染色結果；(D)20倍鏡下QD550-抗HE4抗體及QD620-FA對A549細胞的多重染色結果 圖2　量子點多重染色

2.4量子點穩定性分析隨著時間的推移，QD550的熒光無明顯改變，而FITC的熒光逐漸減弱(圖3A)。QD550的熒光強度值在這期間始終保持在(44.00±1.57)，而FITC由0 min的(40.00±0.76)逐漸減弱到25min的(6.30±1.29)(圖3B)，兩者差異有統計學意義(P<0.05)，表明QDs有較強的抗光漂白能力。

(A)QD550-抗HE4抗體與二抗標記的FITC-抗HE4抗體對SKOV3細胞染色后，在25 min內每隔5 min的熒光變化結果；(B)為A圖每一時刻所對應的熒光強度值 圖3　量子點穩定性分析

3討論

卵巢癌在女性常見惡性腫瘤中發病率為2.4%～6.5%，在各型婦科惡性腫瘤中占第3位，但死亡率卻占首位，75%的卵巢癌患者發現時已為晚期〔4〕。因而對于癌癥早期外周循環腫瘤細胞的檢測將成為卵巢癌早期診斷的一個重要手段，針對卵巢癌SKOV3細胞，選擇特異且具有精確靶向性的生物標記物是檢測的重點。HE4最早是從人的附睪遠端上皮細胞中克隆到的cDNA，隨后證實了其在卵巢癌組織中高表達，而在癌旁組織中不表達〔5〕。而FA是一種分子結構中含有蝶呤環的小分子維生素，為真核細胞單碳代謝和核苷合成所必需。有報道顯示，卵巢癌細胞表面FR呈現高表達(達95%以上)，利用其與FA的高親和力〔6〕，可構建靶向標記卵巢癌細胞或組織的特異性探針，從而達到早期診斷的目的。

利用QDs獨特的光學特性，合成的各種具有生物功能的QDs復合物目前已經在生物標記領域中被廣泛運用。QDs直徑的可調性以及同一激發光可激發不同QDs，這些獨特特征能夠同時分析多種抗原，特別對于復雜的標本需要分析大量參數時很有價值。本文通過利用QDs與SA耦聯的復合物作為特異性探針，能與生物素化的抗體結合，這樣形成的QDs復合物即可用于免疫熒光分析。通過構建的QD-FA及QD-抗HE4抗體靶向熒光探針特異性標記卵巢癌SKOV3細胞，來同時檢測定位于細胞膜及細胞質內的抗原，從而達到多重染色的目的。且相對于單重染色，多重染色在熒光強度的表達上無顯著性差異，并且能夠很大程度地提高檢測的靈敏度與特異性，證實了多重染色的可行性。另外，與傳統染料的對比，顯示了QDs的強抗光漂白能力及良好的穩定性，這在多重染色的多次脫色過程中有著重要意義。

綜上，QDs多重染色可快速、準確地識別卵巢癌細胞，可在細胞形態及分子水平上對卵巢癌細胞進行分析，從而實現卵巢癌的早期診斷，可作為卵巢癌早期檢測的一個新方向。

4參考文獻

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〔2014-10-08修回〕

(編輯郭菁)