沒(méi)食子酸誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)制

沒(méi)食子酸誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)制

羅強(qiáng)任鴻1孫黎郭春燕

(河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北張家口075000)

摘要〔〕目的體外觀(guān)察沒(méi)食子酸對(duì)人宮頸癌Hela生長(zhǎng)及凋亡的影響，探討其抗腫瘤作用。方法體外培養(yǎng)Hela細(xì)胞，用不同濃度的沒(méi)食子酸作用為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，以CCK8法測(cè)細(xì)胞增殖抑制作用、流式細(xì)胞儀檢測(cè)p53和Bcl-2蛋白表達(dá)情況，掃描電鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)的改變。結(jié)果不同濃度沒(méi)食子酸作用Hela細(xì)胞24 h增殖抑制顯著(P<0.05)，其抑制效應(yīng)具有劑量依賴(lài)性，同時(shí)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡、上調(diào)p53基因表達(dá)、下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論沒(méi)食子酸可抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)且隨藥物劑量的增加而升高，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其抗腫瘤效應(yīng)可能與細(xì)胞的基因調(diào)控有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕沒(méi)食子酸；Hela； CCK-8； p53；Bcl-2；凋亡

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R73〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省教育廳資助項(xiàng)目(2007302)

1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院體檢中心

第一作者：羅強(qiáng)(1977-)，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事細(xì)胞生物學(xué)及抗腫瘤機(jī)制研究。

沒(méi)食子酸又名五倍子酸、棓酸,化學(xué)名3,4,5-三羥基苯甲酸(C7H6O5),為白色或淡黃色針狀結(jié)晶或粉末,通常是以一水化合物的形式存在,是一種重要的有機(jī)原料,廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品、染料、輕工及電子等行業(yè)〔1〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸具備一定的抗病毒、抗真菌、抗腫瘤作用〔2〕,且毒性很低,可作為一種潛在的阻止腫瘤發(fā)生的化學(xué)預(yù)防劑〔3〕。但是,對(duì)沒(méi)食子酸抗腫瘤效果仍有爭(zhēng)議〔4〕。本研究觀(guān)察沒(méi)食子酸對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡作用探討其抗腫瘤效應(yīng)。

1材料與方法

1.1 主要試劑和儀器人宮頸癌細(xì)胞株Hela由北京大學(xué)腫瘤防治研究所惠贈(zèng)。RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川頁(yè)生化制品有限公司),CCK-8(上海同仁化學(xué))，碘化丙啶(PI)深圳晶美生物工程有限公司產(chǎn)品；FITC-p53、PE-bcl-2(美國(guó)BD公司)。美國(guó)SpectraMax M2e 多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng),美國(guó) FACSA ria流式細(xì)胞儀，日本HITACHI S-3400N掃描電鏡。

1.2 Hela細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞用含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用不同濃度沒(méi)食子酸處理。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞5×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板,100 μl/孔。 用RPMI1640培養(yǎng)液將沒(méi)食子酸稀釋成7個(gè)不同濃度(0.02，0.04，0.08，0.16，0.32,0.64，1.28 mg/L)，分別加入96孔培養(yǎng)板(100 μl/孔),每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。然后每孔加入CCK-8 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h,之后用SpectraMax M2/M2e多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)吸光度(A490 nm值),按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率；抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A490 nm值/對(duì)照組平均A490 nm值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)p53，bcl-2蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞(密度為1×106/ml)分別接種于4個(gè)50 ml的培養(yǎng)瓶中,貼壁后換不同濃度的沒(méi)食子酸培養(yǎng)液(0.08、0.16、0.32 ng/L)， 對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞，分別加入20 μl FITC-p53及PE-bcl-2孵育20 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 掃描電鏡觀(guān)察將蓋玻片高壓處理后放于六孔板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞(密度為1×106/ml)分別接種到6孔板，使細(xì)胞貼附于蓋玻片上，再用不同濃度的沒(méi)食子酸作用，使用掃描電鏡觀(guān)察形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 沒(méi)食子酸對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響CCK-8法檢測(cè)0.02，0.04，0.08，0.16，0.32,0.64，1.28 mg/L 7個(gè)不同濃度的沒(méi)食子酸作用Hela細(xì)胞24 h，對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)均得到明顯的抑制，并且隨著藥物濃度增加，對(duì)Hela細(xì)胞抑制率增加且生存率下降。見(jiàn)表1。

表1　沒(méi)食子酸對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.2 沒(méi)食子酸對(duì)Hela細(xì)胞p53和bcl-2表達(dá)的影響經(jīng)0.16，0.32,0.64 mg/L 3個(gè)不同濃度的沒(méi)食子酸作用Hela細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，p53表達(dá)明顯增高，bcl-2表達(dá)顯著降低，用藥前后均有顯著差異，且沒(méi)食子酸對(duì)Hela細(xì)胞的作用呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表2。

2.3 沒(méi)食子酸對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)的影響經(jīng)0.32,0.640 mg/L 2個(gè)不同濃度的沒(méi)食子酸作用Hela細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，細(xì)胞間連接中斷，外形皺縮，表面塌陷，形成凋亡小體，見(jiàn)圖1。

圖1　沒(méi)食子酸對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)的影響(掃描電鏡)

組別 p53 bcl-2 均值t值均值t值對(duì)照組1.68±0.10-3.49±0.11-0.16mg/L組3.51±0.13-26.8541)3.52±0.060.0570.32mg/L組7.92±0.07-52.0812)1.56±0.0940.7622)0.64mg/L組15.11±0.09-110.2492)0.79±0.0622.7252)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05,與前濃度組比較：2)P<0.05

3討論

沒(méi)食子酸作為一種有機(jī)酸類(lèi),易被消化道所吸收,其作用機(jī)制已較明確,因其對(duì)肝臟、腎臟、心血管有較強(qiáng)的親和力,生物學(xué)效應(yīng)比較廣泛〔5，6〕,沒(méi)食子酸還具有抗氧化作用〔7，8〕。選擇毒副作用低或無(wú)毒副作用的腫瘤藥物治療策略,是臨床不斷探索的難題〔9〕。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下,遵循自身的程序,自己結(jié)束生命的過(guò)程,最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體,被其他細(xì)胞吞噬,并且在形態(tài)上有一定特征〔10，11〕。中藥抗腫瘤作用的最重要機(jī)制之一是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,從而抑制腫瘤的進(jìn)一步惡化,乃至全部消滅殘留的腫瘤細(xì)胞〔12〕。bcl-2 蛋白家族是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因研究中研究得最多的一類(lèi)蛋白質(zhì)〔13〕。p53 基因?qū)?xì)胞凋亡的調(diào)控是研究得較多的〔14〕。p53 基因?qū)Ψ乐辜?xì)胞增生和保持DNA 受損基因組的完整性有重要作用〔15〕。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法研究發(fā)現(xiàn)： 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的bcl-2 可能通過(guò)阻斷鈣離子 Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)中的流動(dòng),使依賴(lài) Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低,從而阻斷細(xì)胞凋亡〔16〕。有學(xué)者認(rèn)為bcl-2 通過(guò)抗氧化劑或抑制氧自由基的產(chǎn)生而發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡的功能〔17〕。p53 調(diào) 控 一 些 僅 有 BH3 區(qū) 域 的 蛋 白 ,作 為Bax/Bak的上游調(diào)控機(jī)制,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔18，19〕。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明沒(méi)食子酸具有上調(diào)抑癌基因p53的表達(dá)，下調(diào)癌基因bcl-2的表達(dá)作用，而誘發(fā)Hela細(xì)胞凋亡。

4參考文獻(xiàn)

1王之德.重要精細(xì)化學(xué)品——沒(méi)食子酸〔J〕.天然氣化工,1995; 20(1):38-42.

2BarardiD,Simoes CM. Evaluation of anti-HSV-2 activity of gallicacid and pentyl gallate〔J〕.Biol Pharm Bull, 2008; 31(5):903-7.

3Mirvish SS,Cardesa A,Wallcave L,etal.Induction of mouse lung adenomas by amines or ureas plus nitrite and by N-nitroso compounds:effect of ascorbate,gallic acid,thiocyanate,and caffeine〔J〕.Natl Cancer Inst,1975; 55(3):633-6.

4Gorinstein S,Park YS,Heo BG,etal. A comparative study of phenolic compounds and antioxidant and antiproliferative activities in frequently consumed raw vegetables〔J〕.Eur Food Res Technol,2009;228 (6):903-11.

5Bertelli AA,Giovannini L,Stradi R,etal. Plasma,urine and tissue levels of rtans-and cisresveratrol (3,4,5 - trihydroxystilbene) after short-term or prolonged administration of red wine to rats〔J〕.Int J Tissue React,1996(18):67-71.

6Mazza G. Anthocyanins in grapes and grape products〔J〕.Crit Rev Food Sci Nutr,1995(35):34-371.

7Chen HM,Wu YC,Chia YC,etal. Gallic acid,amajor component of Toona sinensis leaf extracts,contains a ROS-mediated anticancer activity in human prostate cancer cells〔J〕.Cancer Lett,2009; 286(2):161-71.

8Giftson JS,Jayanthi S,Nalini N. Chemopreventive efficacy of gallicacid,an antioxidant and anticarcinogenic polyphenol, against 1,2 dimethyl hydrazine induced rat colon carcinogenesis〔J〕.Invest New Drugs,2010; 28(3):251-9.

9陳鵲汀,劉智勤,朱惠學(xué),等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯聯(lián)合環(huán)磷酰胺抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008; 30(16):1568-71.

10Lin QS.Mitochondria and apoptosis〔J〕.Acta Biochim Biophys Sinica,1993;31(2):116-8.

11黃行許,樸英杰,霍霞.p53和細(xì)胞周期停滯及細(xì)胞凋亡〔J〕.解剖科學(xué)進(jìn)展,1996; 2(4):332-7.

12Aghdassi A,Phillips P,Dudeja V,etal. Heat shock protein 70 increases tumorigenicity and inhibits apoptosis in pancreatic adenocarcinoma〔J〕.Cancer Res,2007;67(2):606-25.

13Ishii HH,Gobe GC,Yoneyama J,etal.Role of p53,apoptosis,and cell proliferation in early stage Epstein-Barr virus positive and negative gastric carcinomas〔J〕.J Clin Pathol,2004;57(12):1306-11.

14Heiser D,Labi V,Erlacher M,etal.The Bcl-2 protein family and its role in the development of neoplastic disease〔J〕.Exp Gerontol,2004;39 (8):1125-35.

15Stokke T,Thorstensen L,Lothe RA,etal.Apoptosis and expression of Bax,Bcl-x,and Bcl-2 apoptotic regulatory proteins in colorectal carcinomas,and associations with p53 genotype/phenotype〔J〕.Molecul Pathol,1998;51(5):254-61.

16遲萬(wàn)好,曹明富,朱睦元.細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控研究進(jìn)展〔J〕.杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2001;18(5):46-7.

17Hajnoczky G,Csordas G,Das S,etal. Mitochondrial calcium signalling and cell death:approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+uptake in apoptosis〔J〕.Cell Calcium,2006; 40(5-6):553-60.

18Yu J,Zhang L,Hwang PM,etal.PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells〔J〕.Molecular Cell 2001;7(3):673-82.

19Alvarez S,Drane P,Meiller A.A comprehensive study of p53 transcriptional activity in thymus and spleen of gamma irradiated mouse:high sensitivity of genes involved in the two main apoptotic pathways〔J〕.Int J Radiat Biol,2006;82(11):761-70.

〔2013-12-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)