大劑量當歸預適應抗心肌缺血再灌注后心肌細胞凋亡的機制

大劑量當歸預適應抗心肌缺血再灌注后心肌細胞凋亡的機制

陳彥文1明海霞2劉喜平王強1高曉蘭1郭超1趙英1

(甘肅中醫學院解剖教研室甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅蘭州 730000)

摘要〔〕目的觀察大劑量當歸水煎液預適應對缺血再灌注(IR)大鼠心肌細胞凋亡及心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達的影響。方法應用離體灌流大鼠心臟，復制大鼠心肌IR與缺血預適應(IPC)模型，并以不同大劑量當歸水煎液灌胃6 w后，取大鼠心臟進行離體灌注，復制當歸IPC模型，以TTC法測定心肌梗死面積，以Tunel法檢測細胞凋亡，Western印跡法檢測Bcl-2及Bax蛋白表達。結果大劑量當歸水煎液預適應能有效降低IR大鼠心肌梗死面積，降低心肌細胞的凋亡率，并增加心肌組織Bcl-2的表達而抑制Bax的表達，且呈現明顯劑量-效應關系(P<0.05，P<0.01)。結論大劑量當歸水煎液預適應可增加心肌組織Bcl-2的表達而抑制Bax的表達，從而減少IR大鼠心肌細胞的凋亡，對IR大鼠心肌具有明顯保護作用。

關鍵詞〔〕當歸水煎液；缺血再灌注；細胞凋亡；Bcl-2：Bax

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：甘肅省教育廳

通訊作者：劉喜平(1972-)，男，碩士，教授，碩士生導師，主要從事中藥復方配伍及敦煌古醫方研究。

1甘肅中醫學院生理教研室甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室

2甘肅中醫學院方劑教研室

第一作者：陳彥文(1969-)，男，副教授，主要從事中西結合防治心腦血管疾病基礎研究。

心肌缺血是冠心病的基本病理過程，盡早恢復血供能夠挽救缺血心肌，但再灌注則引起缺血再灌注(IR)損傷。缺血預適應(IPC)是心肌保護的新概念，是迄今為止最強的內源性心肌缺血保護方法。水煎口服是中醫臨床常見給藥途徑，前期研究表明，大劑量岷當歸水煎液預適應可減少或防止大鼠心肌IR室性心律失常的發生，從而減輕IR心肌損傷，對心肌IR后大鼠心功能具有明顯保護作用，但其作用機制不是十分明確〔1〕。本研究對IPC心肌IR大鼠給予不同大劑量當歸水煎液治療， 從細胞凋亡的角度探討大劑量當歸對IR損傷的藥理學預適應作用及機制。

1材料與方法

1.1動物SPF級健康成年雄性SD大鼠40只，體重(200±20)g，由甘肅中醫學院科研實驗中心實驗動室提供，實驗設施使用證SYXK(甘)2009～0006，實驗動物質量合格證SCXK(甘)2009～0006。

1.2 藥品及試劑當歸藥材由蘭州復興厚藥材有限公司提供，經鑒定符合藥典規定；當歸水煎液采用常規煎煮方法，濃縮為1 g/ml；TTC染液購自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Bax福建邁新試劑公司產品。

1.3方法

1.3.1動物分組及模型建立SD大鼠麻醉同時腹腔注射肝素，隨機分為5組，每組8只。開胸取心臟置于冷灌流液中，主動脈逆行插管連接在 Langendorff 離體灌流裝置上，以80 mmH2O 的壓力KH緩沖液灌流心臟，用95%O2和5%CO2混合氣體平衡灌流液。

IR組：大鼠心臟先預灌注平衡 20 min，然后在無灌流液、無氧的條件下，保持心臟溫度恒定在37℃，停止灌流40 min(缺血)，之后再復灌120 min(再灌)；IPC組 ：大鼠心臟先預灌注平衡20 min ，再經短暫的5 min缺血，10 min 再灌注， 重復3 次之后，心臟再經歷 40 min 的缺血，120 min的再灌注；當歸小劑量水煎液+缺血預適應組 ( DL-IPC組) ：給予大鼠當歸小劑量水煎液0.54 g/d(相當于人劑量的30 g)灌胃給藥6 w后，麻醉動物，迅速取心臟連接到離體心臟灌流裝置上，復制心臟IPC 模型(方法同IPC組 )；當歸中劑量水煎液+缺血預適應組 (DM-IPC) ：給予大鼠當歸中劑量水煎液1.08 g/d(相當于人劑量的60 g)灌胃給藥，其余操作同DL-IPC組；當歸大劑量水煎液+缺血預適應組(DH-IPC)：給予大鼠當歸大劑量水煎液2.16 g/d (相當于人劑量的120 g)灌胃給藥，其余操作同DL-IPC組。

1.3.2 TTC染色法測定心肌梗死面積心臟灌流結束后取下心臟，置于-20℃冷凍2 h ，然后，沿從心尖到心底方向，將心臟切成 4 mm厚的切片，將心肌切片置于 2%TTC染液中，37℃孵育20 min，再將切片用10%的甲醛溶液固定。鏡檢觀察，非梗死區染為紅色，梗死區呈蒼白色，紅色區與蒼白色區之間為缺血區。拍照后，用計算機圖像分析系統，計算分析梗死區的面積。

1.3.3 TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡取心室肌組織，切成0.5 cm3的小塊，用4%多聚甲醛磷酸固定，常規脫水、浸蠟、包埋，制成厚度為10 μm的切片，用光鏡觀察細胞凋亡情況。正常心肌細胞核染成藍色，凋亡的細胞核呈棕褐色。每張切片隨機選擇5個視野，光鏡下放大200倍，記錄陽性染色的心肌細胞數及心肌細胞總數，按以下公式計算凋亡指數(AI)：AI=陽性細胞數/心肌細胞總數×100%。

1.3.4 Western印跡法檢測心肌組織Bcl-2與Bax的表達取大鼠心臟組織，提取組織蛋白質，保存備用。超微量分光光度計測蛋白質濃度；取100 μl上清液(細胞裂解液)，取相同質量的細胞裂解液，并加等體積的電泳加樣緩沖液，沸水浴中3 min，上樣、電泳(濃縮膠20 mA，分離膠35 mA)，電轉膜儀轉膜(100 mA 40 min)。膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍染色Western印跡ECL試劑盒顯色，在成像系統上成像記錄結果。以Bcl-2、Bax蛋白及β-actin的比值進行半定量分析。

1.4 統計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積及心肌細胞AI的變化見表1。與IR組相比，IPC組的梗死面積及心肌細胞AI顯著降低(P<0.05)；與IPC組的梗死面積比較， 不同劑量當歸預處理組的梗死面積及心肌細胞AI均顯著降低，且有顯著的劑量-效應關系 (P<0.05，或P<0.01)。

2.2 各組大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達見表2、圖1。與IR組相比，IPC組Bcl-2蛋白的表達增多，Bax的表達減少(P<0.05)。與IPC組比較， 不同劑量當歸預處理組的Bcl-2蛋白的表達增多，Bax蛋白的表達減少，且有顯著的劑量-效應關系，以DH-IPC組效應最為顯著 (P<0.05，P<0.01)。

表1　各組大鼠心肌梗死面積及心肌細胞 ± s, n=8)

與IR組比較 1)P<0.05；與IPC組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

表2　各組大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達

圖1　各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達

3討論

當歸有多種心血管藥理作用，臨床可用于缺血性心臟病的治療，實驗研究表明，當歸注射液對大鼠IR損傷心肌細胞有重要的保護作用〔2〕。湯劑是臨床中藥應用的主要形式，而劑量是影響中藥湯劑功效方向發揮的重要因素，在中國藥典中當歸湯劑的用量規定為6～12 g〔3〕，臨床實踐表明當歸小劑量應用則補血，大劑量應用則活血〔4〕。而“活血”是當歸防治缺血性心肌疾病的主要中藥功效基礎。大劑量當歸水煎液口服給藥防治缺血性心肌疾病則未見報道。

IPC對心肌具有強大的保護作用，但難以應用于臨床，而藥理預適應卻能彌補這一缺陷，藥理預適應是根據IPC機制，通過藥物激發或模擬機體內內源性物質而呈現的保護心臟的作用。心肌缺血和再灌注過程中重要的病理變化就是心肌細胞死亡，其形式之一主要表現為細胞凋亡，而IPC可減少心肌細胞凋亡。研究證明心肌細胞凋亡在心肌IR中普遍存在，并起主導作用〔5〕。心肌細胞凋亡的發生是在多種凋亡基因的調控下進行的，其中 Bcl-2、Bax 相關凋亡基因被認為是最重要的細胞凋亡調控基因，在細胞凋亡的調控中發揮著重要的作用〔6〕。Bax作為Bcl-2的同源體，與Bcl-2一樣在組織中廣泛表達，其作用是抑制Bcl-2表達及活性〔7〕。本研究證實心肌IR可使心肌梗死面積及心肌細胞凋亡顯著增加，IPC則可降低其梗死面積，抑制心肌細胞凋亡，對心肌損傷起到了一定的保護作用。而在IPC的基礎上，給予不同大劑量的當歸水煎劑，均可進一步降低心肌梗死面積，抑制心肌細胞凋亡，尤其以相當于人劑量的120 g的大劑量當歸水煎液最為顯著。其機制可能與上調Bcl-2蛋白的表達，下調Bax蛋白的表達有關。

4參考文獻

1陳彥文，明海霞，王強，等．岷縣當歸預適應對大鼠缺血-再灌注心律失常的影響〔J〕．西部中醫藥，2013;18(2)：15-7．

2優半,張端連．當歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后FAK表達的研究〔J〕．數理醫藥學雜志，2010; 23(1)：28-30．

3國家藥典委員會．中國藥典(一部)〔S〕.北京：中國醫藥科技出版社，2010：124-5.

4仝小林．重劑起沉疴〔M〕.北京：人民衛生出版社，2010：536．

5Machado NG，Alves MG，Carvalho RA，etal．Mitochondrial involvement in cardiac apoptosis during ischemia and reperfusion:can we close the box〔J〕．Cardiovasc Toxicol，2009;9(4)：211-27．

6榮曉鳳,李榮亨,王維．氣虛血瘀證大鼠血管平滑肌細胞bcl-2及bax相關凋亡因子的表達〔J〕．中國老年學雜志,2010;30(5)：648-50．

7王衛東．Bcl-2/Bax比率與細胞“命運”〔J〕．中國腫瘤生物治療學雜志，2007;14 (4)：393-6．

〔2013-12-06修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)