轉化生長因子-β1對巨噬細胞泡沫化過程的影響及其機制

轉化生長因子-β1對巨噬細胞泡沫化過程的影響及其機制

張鳳香賀成業李晨光羅俊生

(遼寧醫學院附屬第一醫院心外科，遼寧錦州121001)

摘要〔〕目的研究轉化生長因子(TGF)-β1是否能通過膽固醇酯水解酶(CEH)對巨噬細胞的泡沫化過程產生影響。方法ox-LDL(100 mg/L)作用48 h，使巨噬細胞轉化為泡沫細胞；Ad-TGF-β1和(或)siRNA CEH作用于巨噬細胞,作用48 h后,分別采用油紅O染色檢測陽性細胞數量；HPLC觀察巨噬細胞內膽固醇代謝情況；Western印跡檢測巨噬細胞內CD36和SR-A1蛋白的表達情況。結果油紅O染色陽性細胞數量：空白對照組59.54±4.01、Ad-TGF-β1組15.12±1.23、Ad-TGF-β1+ siRNA CEH組89.01±3.67、siRNA CEH組94.28±5.22。巨噬細胞內膽固醇酯(CE)、游離膽固醇(FC)和總膽固醇(TC)含量；與空白對照組比較，Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組均增加(P<0.05)；而Ad-TGF-β1組均明顯下降 (P<0.05)。Western印跡法檢測發現：與空白對照組比較，Ad-TGF-β1組CD36和SR-A1蛋白表達均明顯低于；而Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組CD36和SR-A1蛋白表達明顯增強。結論TGF-β1是通過提高CEH的表達來抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉化。

關鍵詞〔〕轉化生長因子-β1; 膽固醇酯水解酶；CD36；清道夫受體A1

中圖分類號〔〕R581；R54〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：遼寧省自然科學基金(2013022010)；遼寧醫學院青年科技啟動

通訊作者：羅俊生(1968-)，男，博士后，主任醫師，主要從事動脈粥樣硬化研究。。

第一作者：張鳳香(1978-)，女，博士，副主任醫師，主要從事動脈粥樣硬化研究。

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的主要病理學基礎，而巨噬細胞轉化為泡沫細胞是 AS 形成的關鍵環節。因此，抑制巨噬細胞源性的泡沫細胞形成是預防AS 形成的重要步驟。轉化生長因子(TGF)-β1是一種具有多種生物學功能的生長因子,當TGF-β1在巨噬細胞中的表達發生變化時可以影響巨噬細胞向泡沫細胞的轉化〔1〕。但目前TGF-β1影響巨噬細胞轉化為泡沫細胞的具體機制尚不得而知。前期研究證明，在巨噬細胞內TGF-β1的表達與CEH的表達呈正相關。本文探討TGF-β1能否通過CEH來影響巨噬細胞向泡沫細胞的轉化。

1材料和方法

1.1 材料THP-1人單核巨噬細胞購自中國科學院上海生物研究所細胞庫;ox-LDL購自北京生物技術公司;胎牛血清和胰蛋白酶購自碧云天公司; 兔抗鼠SR-A單克隆抗體、兔抗鼠和CD36單克隆抗體、小鼠抗β-actin 單克隆抗體、PCR試劑盒、HRP 標記山羊抗小鼠二抗均購自北京中杉金橋公司；羊抗兔二抗購自Jackson IR Labs公司;逆轉錄試劑盒購自大連寶生物公司；人源重組腺病毒載體Ad-TGF-β1購自Gibco公司；siRNA CEH購自QIAGEN公司。

1.2 誘導巨噬細胞泡沫化形成及分組凍存的人 THP-1 單核細胞置于 37℃水浴中 1 min 內快速復蘇，培養于 含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，于 37℃、5%二氧化碳(CO2)培養箱中靜置培養，每隔 3～5 d傳代1次，細胞密度為1×106個/ml。取對數生長期的細胞，然后加入ox-LDL(100 mg/L)共同培養48 h,誘導泡沫細胞形成。將誘導的泡沫細胞分為4組：①空白對照組；②Ad-TGF-β1組;③Ad-TGF-β1+siRNA CEH組；④siRNA CEH組，再培養48 h，隨后收集細胞。

1.3 油紅O染色及脂質染色的半定量分析將油紅 O 儲存液與蒸餾水按 3∶2 比例混合，靜置 5 min 后雙層濾紙過濾(全過程避光)；將細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗2遍，吸干水分；室溫下 10%甲醛固定 30 min；用配制好的油紅染液避光染 40 min；60%異丙醇洗脫10 s；用蒸餾水洗去異丙醇，封片。 根據細胞脂滴的面積進行細胞分類;細胞脂滴的面積小于細胞核的面積記為“-”;細胞脂滴的面積≥細胞核的面積記為“+”,即為油紅O染色細胞;每塊玻片計數100個細胞。

1.4 高效液相色譜分析(HPLC)分析細胞內膽固醇含量待細胞處理結束后,棄去培養基,PBS液洗3遍;加入1 ml 0.9% NaCl溶液重新稀釋細胞,反復凍融,冰浴中超聲裂解細胞(600 W,20 s)。4℃、10 000 r/min離心15 min,辛可酸液進行蛋白定量;將細胞溶解產物分為等體積的兩組;加入等體積的新鮮配制的15%KOH醇溶液,室溫渦旋至細胞溶解產物清亮;分別加入6%的三氯乙酸去蛋白。 再加入等體積的正己烷∶異丙醇溶液(4∶1,V/V),將混合物渦旋5 min;1 500 r/min速度離心 5 min。收集上層有機相;將下層水相按上述方法重復抽提 2次; 將混合的有機相在真空冷凍干燥機中干燥,在室溫冷卻;加入100 μl異丙醇∶正庚烷∶乙腈(35∶12∶52,V/V) 將樣本溶解,活性炭去色素;超聲除氣 5 min,1 500 r/min離心 5 min,收集上清液;取10 μl進樣,進行HPLC分析，檢測膽固醇酯(CE)、游離膽固醇(FC)、總膽固醇(TC)。

1.5 Western印跡法檢測裂解細胞提取細胞總蛋白,BCA試劑盒定量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,恒壓電轉移至硝酸纖維素膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,清道夫受體(SR)-A(1∶500) 和CD36(1∶1 000)37℃孵育2 h,TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶500)，4℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL發光試劑盒發光顯影，凝膠成像。

1.6 統計學方法采用SPSS13.0軟件進行正態性和方差齊性檢驗，兩樣本的均數比較采用t檢驗。

2結果

2.1 Ad-TGF-β1和(或)siRNA CEH對巨噬細胞泡沫化的影響空白對照組陽性細胞數量為59.54±4.01、Ad-TGF-β1組陽性細胞數量為15.12±1.23、Ad-TGF-β1+siRNA CEH組陽性細胞數量為89.01±3.67、siRNA CEH組陽性細胞數量為94.28±5.22。與空白對照組比較,Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組陽性細胞數量明顯增加(P<0.05)，但Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組陽性細胞數量無明顯差異(P>0.05)；而Ad-TGF-β1組陽性細胞與空白對照組比較陽性細胞數量明顯降低(P<0.05)。見圖1。

2.2 Ad-TGF-β1和/或siRNA CEH對巨噬細胞內膽固醇代謝的影響HPLC檢測結果顯示：與空白對照組比較，Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組巨噬細胞內CE、FC和TC含量均增加(P<0.05)；而Ad-TGF-β1組與空白對照組比較巨噬細胞內CE、FC和TC含量均明顯下降 (P<0.05)。說明Ad-TGF-β1可以減少CE在細胞內聚集并加強FC的流出(均P<0.05)。見表1。

2.3 Ad-TGF-β1和(或)siRNA CEH對巨噬細胞中CD36和SR-A1蛋白表達的影響見圖2。Ad-TGF-β1組CD36和清道夫受體(SR)-A1蛋白表達均明顯低于空白對照組；而Ad-TGF-β1+siRNA CEH組和siRNA CEH組CD36和SR-A1蛋白表達明顯高于空白對照組(P<0.05)。

圖1　油紅O染色顯示各組巨噬細胞泡沫化情況(×400)

組別CE(mg/ml)FC(mg/ml)TC(mg/ml)CE/TC(%)空白對照組50.17±3.1137.21±1.0376.23±4.2565.76±2.37Ad-TGF-β1組11.57±2.011)9.58±1.021)42.59±2.351)27.10±2.011)Ad-TGF-β1+siRNACEH組79.54±5.021)52.65±3.121)98.16±4.231)81.03±2.121)siRNACEH組86.21±3.251)59.06±2.541)106.01±5.221)81.31±3.041)

與空白對照組比較：1)P<0.05

1.siRNA CEH 組;2.Ad-TGF-β1 組;3.Ad-TGF-β1+siRNA CEH組;4.空白對照組 圖2　Western印跡檢測各組巨噬細胞CD36和 SR-A1蛋白表達的影響

3討論

泡沫細胞的形成是AS的顯著特征。血液系統中的單核巨噬細胞遷移到血管內皮下吞噬大量脂質后形成泡沫細胞,泡沫細胞釋放的CE和FC在血管壁損傷處大量聚集形成了AS斑塊脂質核心。近來研究表明,CEH介導的細胞內CE水解作用,能夠促進CE水解為FC,并促進FC外流到細胞外受體,從而同時減少了細胞內CE和FC的聚集〔2〕。 TGF-β1屬TGF-β超家族，是一種分子量為25 000 kD的多肽,是由巨噬細胞、血小板、血管內皮及平滑肌細胞等分泌,在AS發生、發展過程中起重要作用〔3〕。研究表明巨噬細胞攝取脂蛋白和巨噬細胞泡沫化轉化的形成與巨噬細胞TGF-β1濃度呈負相關，但其具體機制尚不清楚〔4〕。本研究結果說明增加TGF-β1的表達可以有效抑制細胞泡沫化,減少CE在細胞內聚集并加強FC的流出,抑制泡沫細胞的形成。但當沉默CEH的表達時TGF-β1這種抑制泡沫細胞形成的作用卻被明顯降低。巨噬細胞可以表達多種SRs,包括SR-A、SR-BI、CD36、CD68及磷脂酰絲氨酸和氧化脂蛋白的SR，其中CD36和SR-A被認為是主要的致AS受體，在AS的形成過程中起重要作用〔5～7〕。研究證實，SR-A、CD36介導的膽固醇流入直接影響了巨噬細胞轉化為泡沫細胞的程度〔8，9]。同時研究還發現，TGF-β1能通過影響SR-A和CD36的表達來抑制AS的發生、發展過程，但具體機制尚不清楚〔10，11〕。本實驗結果說明，TGF-β1可能是通過CEH來影響CD36和SR-A1的表達的。綜上，TGF-β1可能是通過CEH來影響巨噬細胞的泡沫化進程。

4參考文獻

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〔2013-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)