黃芪總皂苷對內質網應激誘導的心肌細胞肥大模型的保護作用

黃芪總皂苷對內質網應激誘導的心肌細胞肥大模型的保護作用

顧靜李海龍劉凱李應東明海霞李楊吳紅彥

(甘肅中醫學院基礎課部甘肅省中醫方藥挖掘與創新轉化重點實驗室，甘肅蘭州730000)

摘要〔〕目的觀察內質網應激(ERS)對心肌肥大的影響，探討黃芪總皂苷對ERS誘導的心肌細胞肥大的保護作用。方法心肌細胞原代培養，實驗分為對照組、衣霉素(TM)組、黃芪總皂苷聯合TM(AST+TM)組。通過測定心肌細胞蛋白質合成速度、心肌細胞表面積觀察心肌細胞肥大，通過內質網染色以及RT-PCR檢測葡萄糖調節蛋白(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)mRNA的表達觀察心肌細胞ERS反應。結果與對照組相比，TM組心肌細胞蛋白質合成速度提高、心肌細胞表面積增加，ERS分子GRP78和CHOP mRNA表達增加，均有顯著性差異(P<0.01)，內質網形態改變與TM組相比，AST+TM組心肌細胞蛋白質合成速度降低、心肌細胞表面積減小， GRP78和CHOP mRNA表達降低，均有顯著性差異(P<0.01)，內質網形態恢復，與對照組類似。結論ERS誘導劑TM誘導心肌細胞顯著肥大,同時伴隨ERS反應，黃芪總皂苷可以通過減弱ERS反應而抑制TM誘導的心肌細胞肥大。

關鍵詞〔〕內質網應激；心肌細胞；心肌肥大；黃芪皂苷

中圖分類號〔〕R542.2〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：甘肅省中藥管理局項目(GZK-2014-79)；高校基本科研業務費(GZY2012-1)；甘肅省自然科學基金項目(1310RJZA088)

通訊作者：吳紅彥(1963-)，男，教授，博士生導師，主要從事心腦血管疾病臨床與基礎研究。

第一作者：顧靜(1980-)，女，副教授，博士，主要從事心血管藥理生理學和循證中醫藥研究。

內質網應激(ERS)近年來受到高度關注，適度的ERS是一種進化上高度保守的細胞保護機制，有助于細胞內鈣和蛋白質加工等穩態恢復正常，增強細胞耐受應激刺激的能力；但是持續而嚴重的ERS觸發細胞凋亡，造成細胞損傷。多種致心肌肥大因素，如壓力過負荷、自身免疫性心肌病、缺血缺氧、糖尿病性心肌病、血管活性物質異常和慢性酒精中毒致心肌肥大過程中均出現ERS反應〔1～6〕，提示ERS反應可能是上述因素致心肌肥大發生、發展的機制之一。黃芪具有多方面的藥理作用特別是具有明顯的心血管作用，包括強心作用，對心肌缺血、缺血/再灌損傷以及感染病毒心肌具有明顯的保護作用，其機制主要與黃芪調節細胞內鈣有關，而鈣穩態失衡是ERS的一個重要方面。本文研究黃芪總皂苷對ERS誘導的心肌細胞肥大模型的影響，探討黃芪對心肌的保護是否通過ERS途徑起作用。

1材料與儀器

1.1細胞小鼠原代心肌細胞購自齊氏生物科技有限公司。

1.2藥物與試劑胰蛋白酶、DMSO均購自Amresco公司，DMEM/F12和胎牛血清購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司，批號分別是:NYB0810和NY0814，黃芪總皂苷(AST)購自上海源葉生物試劑有限公司，批號:ZA0424LA13，衣霉素(TM)購自美國Sigma公司，〔3H〕-亮氨酸購自英國GE Healthcare公司，GENMED內質網(ER)形態染色試劑盒購自美國Genmed Science Inc 公司。

1.3儀器CO2培養箱(SANYO Electric Co Ltd,型號：MAO-18ALC),超凈工作臺(蘇州凈化儀器廠，型號：SW-CJ-2FD),倒置熒光顯微鏡CK2(日本Olympus公司),多功能液閃儀LS6500型(美國Beckman公司)。

1.4方法

1.4.1心肌細胞培養及分組將小鼠心肌細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，培養條件：37℃、100% 濕度、5%CO2、95%空氣，每48小時換液一次。實驗分為3組：①對照組：細胞置CO2孵箱37℃常規培養至實驗結束。②TM組：培養液內加入TM(10 ng/ml通過預試驗確定)處理心肌細胞72 h。③TM+AST組：細胞培養液內同時加入AST(終濃度10 ng/ml通過預試驗確定)和TM(終濃度為10 ng/ml)孵育72 h結束實驗。

1.4.2蛋白質合成速率測定采用〔3H〕-亮氨酸摻入技術測定心肌細胞蛋白質合成速率。實驗結束前12 h，按照0.5 μCi/孔加入〔3H〕-亮氨酸孵育12 h。實驗結束后用預冷PBS沖洗細胞3次，每孔內加入150 μl甲酸，室溫消化30 min后全部移入液閃瓶。LS6500多功能液閃儀檢測心肌細胞〔3H〕-亮氨酸放射性強度，以每分鐘校正計數(CCPM)表示。同時按照Bradford法蛋白定量方法測定每組心肌細胞蛋白含量，以每毫克蛋白CCPM反映各組蛋白質合成速率變化。

1.4.3心肌細胞表面積測定單個生長培養細胞，置于Olympus倒置顯微鏡下采集心肌細胞圖像，采用Image-Pro Plus軟件分析各組心肌細胞表面積。

1.4.4ER染色獲得單個生長培養細胞，按照GENMEDER染色試劑盒操作說明進行ER染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察：激發波長370 nm，散發波長460 nm(ER呈現藍色)。

1.4.5RT-PCR技術檢測ERS標志性基因CHOP、GRP78mRNA表達收集各組細胞，用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，鑒定RNA完整性和純度。GAPDH引物序列正義鏈5'-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3'， 反義鏈5'-TCACCATCTTTCCAGGAGCGAG-3'； CHOP引物序列正義鏈5'-AGCTGGAAGCCTGGTATGAG-3'， 反義鏈5'-GACCACTCTGTTTCCGTTTC-3'；GRP78引物序列正義鏈5'-TCTGGTTGGCGGATCTACTC-3'， 反義鏈5'-TCTTTTGTCAGGGGTCGTTC-3'。PCR反應參數為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環后，72℃延伸10 min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統拍照并對DNA目的條帶進行掃描，以GAPDH為內參分析各基因相對表達水平。

1.5統計學方法應用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2結果

2.1心肌細胞蛋白質合成速率 10 ng/ml TM作用72 h，心肌細胞蛋白質合成速率較對照組增加204.76%(P<0.05)；10 ng/ml AST聯合10 ng/ml TM共同作用72 h，心肌細胞蛋白質合成速率較10 ng/ml TM組下降46.88%(P<0.05)，與對照組相比增加了61.98%(P<0.05)，提示AST能抑制TM誘導的心肌細胞蛋白質合成速率的增加，緩解蛋白質合成增加造成的心肌細胞肥大。

2.2心肌細胞表面積測定10 ng/ml TM作用72 h，心肌細胞表面積較對照組增加100.5%(P<0.05)；10 ng/ml AST聯合10 ng/ml TM共同作用72 h，心肌細胞表面積較10 ng/ml TM組顯著下降40.70%(P<0.05)，與對照組相比增加了19.1%(P>0.05)，提示AST能部分地抑制TM誘導的心肌細胞表面積增加。

2.3ER形態變化采用ER特異性染料Dapoxyl觀察心肌細胞ER形態改變，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示正常心肌細胞ER均勻分布在核周，無空泡出現；10 ng/ml TM作用72 h后心肌細胞ER結構嚴重受損，熒光顆粒分布不均、濃集，并有空泡形成，表明ER應激誘導劑TM誘導心肌細胞ER顯著損傷，出現ERS；10 ng/ml AST聯合10 ng/ml TM共同作用72 h，上述結構損傷減弱或未見。

2.4ERS分子表達變化前述實驗證實10 ng/ml TM作用72 h心肌細胞顯著肥大，我們在該肥大模型上觀察了ERS分子的表達變化及10 ng/ml AST對其影響。RT-PCR證實10 ng/ml TM作用72 h誘導心肌細胞ERS分子顯著增加，CHOP、GRP78 mRNA表達較對照組增加265.45%和172.33%(P<0.05)；10 ng/ml AST聯合10 ng/ml TM共同作用72 h，CHOP、GRP78 mRNA表達較TM組分別降低了64.38%和55.88%(P<0.05)，與對照組相比分別增加了21.12%和32.1%無顯著差異(P>0.05)。 CHOP、GRP78是ERS的重要標志性蛋白，上述結果提示TM誘導心肌細胞顯著ERS，AST能抑制TM誘導的ERS標志蛋白的表達，見圖1。

1，2：對照組；3、4：TM組；5、6：AST+TM組 圖1　心肌細胞ERS分子表達

3討論

慢性心肌肥大向心力衰竭發展的過程是心臟重構的過程，這一病理過程包括心肌細胞體積增大、直徑增寬或長度增加，并伴隨著壞死、凋亡造成的心肌細胞丟失，以及間質纖維化等，整體表現為心臟重量增加，室壁變厚，功能減弱。Hamada等〔4〕曾使用抑制蛋白質糖基化而誘導ERS的TM觀察心肌細胞ERS分子的表達，在KDEL受體突變的心肌細胞ER內GRP78的表達明顯增加，并出現ERS相關凋亡途徑的標志分子CHOP 聚集，提示蛋白質量控制異常引起的ERS相關心肌細胞凋亡是KDEL受體突變小鼠擴張型心肌病發生的重要機制。

未折疊蛋白反應(UPR)是研究最為充分的一類ERS反應，與心肌肥大的發病密切相關，主要表現為蛋白質合成暫停、ER功能相關蛋白質表達上調〔7〕以及促進ER內錯誤折疊蛋白質降解，以重建ER內環境穩態。目前認為ERS時蛋白質合成調節主要涉及三個ER跨膜效應蛋白:PERK、鐵反應元件(IRE)1和激活型轉錄因子(ATF)6〔8〕。正常情況下，這三種蛋白的ER腔側都與GRP78結合而處于無活性狀態，當ER腔內未折疊蛋白/錯誤折疊蛋白聚集超過ER處理范圍時，GRP78即從這三種蛋白上解離而與未折疊蛋白/誤折疊蛋白結合以協助其正確折疊，GRP78的解離促進PERK、IRE1、ATF6活化進而觸發ERS信號轉導。當ERS延長時，激活轉錄因子(ATF)4持續表達介導參與細胞凋亡基因的上調，如ATF4誘導CHOP〔9〕表達。可見，細胞一方面積極調動應激反應蛋白(如GRP78、ATF6、ATF4等)的表達以抵御病理因素造成的細胞損傷，調整ER功能以適應新的內環境變化要求，另一方面誘導凋亡相關基因CHOP表達增加，以清除功能不能恢復的細胞。

本實驗發現，① TM誘導培養心肌細胞發生ERS反應，表現為ERS的標志分子GRP78 mRNA表達上調，心肌細胞ER形態嚴重破壞，熒光顆粒分布不均，ER內出現空泡；②ERS誘導劑TM也顯著誘導培養心肌細胞肥大，表現為心肌蛋白質合成速率增加和細胞表面積增加；③ TM促進心肌細胞CHOP表達增加，說明ERS激活心肌細胞CHOP凋亡相關途徑并參與了TM誘導的肥大心肌細胞損傷，由此進一步證實ERS參與了心肌肥大的發生、發展過程。

此外，本實驗表明AST有顯著抑制心肌細胞肥大的效應；與此同時心肌細胞ER的形態和ERS相關分子GRP78、CHOP表達也趨于正常，這提示AST抑制心肌細胞肥大可能與其抑制ERS有關，但其具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

4參考文獻

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〔2013-12-30修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)