瑞舒伐他汀對ApoE-/-小鼠動脈粥樣斑塊中凋亡相關蛋白的影響

瑞舒伐他汀對ApoE-/-小鼠動脈粥樣斑塊中凋亡相關蛋白的影響

陳建昌高國潔李鳳玲郝躍偉劉偉魏金省

(山東大學附屬省立醫院急診科，山東濟南 250022)

摘要〔〕目的觀察瑞舒伐他汀對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊凋亡相關蛋白Bcl-2和Caspase-3表達的影響。方法10只C57小鼠作為對照組，給予普通飲食，同品系22只ApoE-/-小鼠隨機分為模型組(n=11)、干預組(n=11)，高脂喂養8 w后，干預組給予瑞舒伐他汀懸液灌胃，模型組給予等量生理鹽水。繼續喂養12 w后所有老鼠處死，全自動生化儀檢測血清血脂，光學顯微鏡觀察各組小鼠主動脈斑塊形態及面積，免疫組化法檢測動脈粥樣斑塊Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達。結果與對照組相比較，模型組總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)明顯升高(P<0.05)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)明顯降低(P<0.05)；主動脈可見明顯粥樣斑塊；Bcl-2表達明顯減少，Caspase-3表達明顯增多(P<0.05)。與模型組比較，TC、TG、LDL-C明顯降低(P<0.05)；干預組小鼠動脈粥樣斑塊面積減小(P<0.05)， Bcl-2表達明顯增多，Caspase-3表達明顯減少(P<0.05)。結論高脂飲食可引起ApoE-/-小鼠主動脈凋亡相關蛋白Bcl-2和Caspase-3的變化，瑞舒伐他汀可以通過上調Bcl-2、下調Caspase-3的表達，抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的進展。

關鍵詞〔〕瑞舒伐他汀； ApoE-/-小鼠； 動脈粥樣硬化；Bcl-2； Caspase-3

中圖分類號〔〕R541.4〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：陳建昌(1962-)，男，副主任醫師，主要從事急診急救醫學研究。

動脈粥樣硬化(AS)發生發展中，高脂質負荷及氧化修飾和炎癥差異調節著血管細胞的增殖、凋亡〔1〕。AS斑塊中常檢測到大量巨噬細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞的凋亡，造成內皮功能障礙，脂質核心增大，斑塊纖維帽變薄，形成不穩定斑塊，易發生急性冠脈綜合征(ACS)〔2〕。他汀類藥物最初作為強有效的調脂藥物應用于臨床，最新研究表明其可通過抗炎、抗氧化等作用穩定斑塊，延緩甚至逆轉斑塊進展，其獨立于調脂以外的作用機制已成為研究熱點，目前仍有新的作用機制被發現，其是否也通過調控凋亡相關基因抑制細胞凋亡從而穩定斑塊，尚不清楚。Bcl-2蛋白是體內外凋亡信號轉導通路的重要調節器，尤其在氧化應激和炎癥導致的血管細胞凋亡中起重要調節作用〔1〕。本實驗通過檢測瑞舒伐他汀對小鼠AS斑塊中凋亡相關蛋白Bcl-2、Caspase-3表達的影響，探究他汀類藥物對AS斑塊內細胞凋亡的作用，為尋找AS新的治療靶點和干預措施提供了新思路。

1材料與方法

1.1材料與儀器雄性C57BL/6J小鼠、同品系ApoE-/-小鼠購自北京大學醫學部實驗動物科學部，動物合格證號：SCXK(京)2011-0012。高脂及普通飼料購自山東大學醫學部。瑞舒伐他汀鈣片(批號：H20060406)由阿斯利康制藥有限公司生產，用生理鹽水配置成懸液。一抗：Bcl-2、Caspase-1兔抗小鼠單克隆抗體購自美國Immunoway，公司，二抗辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG多聚體、血脂測試試劑盒、PV9000免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自青島昊航科貿有限公司，顯微鏡攝像機、光學顯微鏡、切片機、全自動血生化儀用自山東大學醫學部。

1.2方法

1.2.1小鼠模型與分組健康雄性8周齡C57小鼠10只，體重(18.4±3.1)g為對照組，給予普通飼料喂養，同一品系健康雄性8周齡ApoE-/-小鼠22只，體重(19.2±2.3)g，普通飼料適應性喂養1 w后，將ApoE-/-小鼠隨機分為模型組與干預組，每組11只，均給予高脂飼料，喂養8 w后，給予干預組瑞舒伐他汀鈣懸液10 mg·kg-1·d-1灌胃，每次灌胃量0.2 ml，普通組給予等量生理鹽水灌胃，ApoE-/-小鼠繼續高脂飼料喂養，對照組普通飼料喂養，飲水不限制，持續12 w，其中模型組因撕咬死亡1只，干預組因灌胃窒息死亡1只。

1.2.2血脂測定最后一次給藥后，所有小鼠禁食水12 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，眼球取血，每只小鼠取血量約0.5 ml左右，靜置2 h后以6 000 r/min，10 min高速離心，取上層血清，使用全自動血生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.2.3病理形態學檢查取完血后快速打開小鼠胸腹腔，由主動脈根部離斷血管，游離整個主動脈剪斷，冰生理鹽水沖洗，快速放入4%中性多聚甲醛內固定12 h。常規石蠟包埋、切片，蘇木精伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察，Image-Pro Plus Version 6.0(IPP)圖像分析處理軟件計算小鼠管腔面積和斑塊面積。

1.2.4Bcl-2、Caspase-1免疫組化檢測取完血后取主動脈，用冰生理鹽水沖洗，4%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，以5 μm厚度切片，脫蠟、水化，放入抗原修復液中，將容器異同放入高壓鍋中加熱行高壓抗原修復，冷卻至室溫，PBS洗3次，3% H2O2去離子水孵育10 min，分別滴加一抗 Bcl-2、Caspase-1(1∶100)，4℃過夜，滴加二抗為辣根過氧化酶標記羊抗小鼠IgG多聚體，室溫孵育20 min，PBS沖洗、DAB顯色后進行蘇木素核復染，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取4個視野，Bcl-2、Caspase-1均以胞質中出現棕黃色為陽性表達，觀察并拍照，計算陽性細胞表達量，取其平均值。

1.3統計學分析采用SPSS15.0軟件行配對t、χ2檢驗及F檢驗。

2結果

2.1各組小鼠血脂檢測模型組ApoE-/- 小鼠TC、TG、LDL-C水平均高于對照組(P<0.05)，HDL-C水平低于對照組(P<0.05)。干預組ApoE-/-小鼠TC、TG、LDL-C水平均低于模型組(P<0.05)，HDL-C水平升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組小鼠血脂水平的比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2小鼠血管壁病理改變HE染色顯示對照組小鼠主動脈內膜光滑無中斷，中膜、外膜分界清晰，與內膜平行，細胞排列規則。模型組小鼠主動脈壁層次尚清晰，內膜明顯增厚，向管腔突出，內皮細胞壞死、脫落造成內膜中斷。中膜平滑肌細胞大量增殖，排列紊亂，侵入內膜下，形成粥樣斑塊，內見大量泡沫細胞及壞死灶。干預組較模型組內膜增厚減輕，斑塊明顯縮小，病變程度減輕。見圖1，表2。

表2　各組小鼠主動脈斑塊和管腔面積比較 ± s, n=10)

2.3小鼠主動脈Caspase-3 、Bcl-2 免疫組化檢測對照組主動脈細胞胞質有少量棕黃色顆粒物表達。模型組與干預組均可見棕黃色Caspase-3 、Bcl-2 陽性表達。與對照組相比，模型組平滑肌細胞內、粥樣斑塊中Caspase-3 表達明顯增加，Bcl-2 陽性表達減少但無統計學意義；與模型組相比，干預組平滑肌細胞、粥樣斑塊內Bcl-2陽性細胞表達明顯增加(P<0.05)，Caspase-3陽性細胞表達減少(P<0.05)。見圖1、圖2，表3。

圖1　小鼠主動脈Caspase-3表達(DAB，×400)

圖2　小鼠主動脈Bcl-2表達(DAB，×400)

組別Caspase-3Bcl-2對照組7.1±2.25.2±1.2模型組15.6±2.31)4.2±1.5干預組10.5±2.32)9.6±3.42)

3討論

細胞凋亡是腫瘤、糖尿病等疾病的發生機制之一，近年來觀察發現，凋亡也廣泛參與AS的發生。研究表明AS斑塊浸潤大量炎性細胞并且易發生細胞凋亡，導致脂質核心的形成〔3〕。血管平滑肌細胞、內皮細胞、巨噬細胞的凋亡促進脂質沉積，核心增大，形成易損斑塊〔4〕。內皮損傷是AS發生的起始環節〔5〕，據報道內皮細胞的凋亡導致AS斑塊不穩定性，易血栓形成，導致ACS〔6〕。氧自由基或細胞內氧化代謝產物可以攻擊多不飽和脂肪酸，啟動脂質過氧化鏈式反應，其中最主要的是LDL被氧化成ox-LDL，ox-LDL與內皮細胞上過表達的受體LOX-1結合，使 p38MAPK 磷酸化，激活Caspase-3，誘導NF-κB轉位到核膜，直接或間接的促進Caspase-3的活化并下調bcl-2的表達，使內皮細胞受損〔7〕，分泌功能紊亂，導致內皮細胞凋亡，抗氧化能力減弱。

巨噬細胞凋亡同樣參與AS進展，富含巨噬細胞區域比如斑塊的“肩部”細胞凋亡通常要高于其他區域〔8〕，巨噬細胞吞噬過多的ox-LDL，發生凋亡后如未能及時被清除則發生繼發性壞死，壞死細胞碎片同時也是強烈的促炎因子，可誘發一系列炎癥反應，造成斑塊不穩定性，易破裂導致ACS。Hartung等〔9〕制備了晚期AS斑塊模型，然后給予他汀類凋脂治療，觀察到粥樣硬化斑塊巨噬細胞炎性浸潤減少和血管平滑肌細胞含量增加，而巨噬細胞凋亡明顯減少，從而表明巨噬細胞凋亡減少可能有助于斑塊的穩定。Bcl-2 在AS斑塊平滑肌細胞中共表達，可與Bax 凋亡基因拮抗，調節平滑肌細胞的基質分泌，阻止凋亡過度表達而使斑塊穩定。

細胞凋亡有兩條誘導通路，一個是死亡受體通路另一個是細胞應激途徑。這兩條通路都起始于Caspase-3的激活〔10〕因此Caspase-3被認為是細胞凋亡的關鍵酶。線粒體在Caspase活化誘導的細胞凋亡中發揮重要作用。線粒體釋放細胞色素C到胞質， 使前體Caspase-3 (32 kD)被激活，進一步被切割為兩部分：p17片段(17 kD) 和p12 片段(12 kD)。Caspase通過識別核糖聚合酶PARP的裂解片段，誘導凋亡〔11〕。

Bcl-2 基因家族，是最重要的細胞凋亡控制基因，其編碼的Bcl-2抗凋亡蛋白，可以阻止化療藥物、紫外線輻射、自由基損傷導致的細胞凋亡〔12〕。Bcl-2家族可以調控巨噬細胞凋亡〔13〕。Bc l-2和Bax均屬于Bcl-2基因家族，促凋亡蛋白Bax可以插入線粒體外膜，進入線粒體觸發凋亡因子釋放，如細胞色素C。同時，抗凋亡蛋白Bcl-2可以阻止線粒體分解及細胞色素C的釋放，從而組織細胞凋亡。Bai等〔14〕發現上調Bcl-2的表達可以減少細胞色素C的釋放，抑制oxLDL導致的巨噬細胞凋亡。Bcl-2對Caspase有抑制作用，參與對Caspase活性的調節，可抑制過度表達Caspase-3所誘導的細胞凋亡。研究表明Bcl-2蛋白環區的天冬氨酸(Asp34)是Caspase-3的酶解位點，Bcl-2對細胞凋亡的抑制同時受到Caspase-3的調節，Caspase-3能夠在Asp34的位置切割Bcl-2蛋白使其發生裂解，被裂解的Bcl-2可以向線粒體外膜轉移，通過BH3和跨膜結構域進而上調細胞凋亡過程。

本實驗成功通過高脂喂養AproE-/-小鼠構建動物AS模型，進行瑞舒伐他汀干預可以明顯減小主動脈AS斑塊，與Hartung等〔9〕研究一致。本研究表明，與對照組相比，通過免疫組化法檢測主動脈壁Bcl-2、Caspase-3的表達，發現模型組小鼠主動脈Caspase-3、Bcl-2均有表達，Caspase-3表達明顯增多，陽性細胞多聚集于粥樣硬化斑塊附近，尤其是脂質核心和粥樣斑塊纖維帽肩部，而在正常小鼠血管壁內很少見到陽性細胞，說明在動脈粥樣硬化發生過程中，細胞凋亡發生頻繁，并激活抗凋亡蛋白。這可能是由于機體異常高脂血癥，促進前體Caspase-3分割成有活性的Caspase-3，Caspase-3可以使Bcl-2酶解，減少了內皮細胞 Bcl-2的表達，從而導致血管內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞的凋亡。與模型組相比較，瑞舒伐他汀干預組小鼠凋亡相關蛋白Caspase-3表達水平降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平升高，在血管內膜、中膜均有表達，說明瑞舒伐他汀可能通過減少Caspase-3的活化并增加Bcl-2 的表達，改善血管細胞凋亡情況，減少內皮細胞受損，抑制平滑肌細胞凋亡，減少巨噬細胞凋亡，穩定斑塊，延緩動脈粥樣硬化的發生。但本實驗樣本數量有限，調節調節Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達的分子機制還不十分清楚，應用于臨床還有一定距離。

4參考文獻

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〔2014-09-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)