結直腸癌組織PDCD4、PAQR3 mRNA水平及意義

結直腸癌組織PDCD4、PAQR3mRNA水平及意義

李日恒楊瑞紅1宋艷敏賈佳丁麗坤2鄭三龍2曹永樹2張愛民胡光

(河北大學附屬醫院，河北保定071000)

摘要〔〕目的探討結直腸癌組織中PDCD4和PAQR3 mRNA表達情況，以及與結直腸癌臨床資料之間的關系。方法收集結直腸癌及癌旁正常組織標本各54例，用RT-PCR法檢測結直腸標本中PDCD4和PAQR3 mRNA水平；分析PDCD4 和PAQR3 mRNA水平與臨床資料之間的關系。結果(1)結直腸癌組織中PDCD4 mRNA表達降低甚至不表達，表達降低率為35/54(64.8%)，PDCD4 mRNA表達水平為6.84±3.60，癌旁正常組織為5.88±2.52，差異有統計學意義(P=0.036)。癌組織中PAQR3 mRNA表達水平降低，甚至不表達，表達降低率為57.4%(31/54)，PAQR3 mRNA表達水平為9.32±1.97，癌旁正常組織為8.44±2.42，差異有統計學意義(P=0.001);二者無相關性(R=0.129，P=0.532)。(2)結直腸癌組織中PDCD4 和PAQR3 mRNA均與分化程度、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關，與性別、年齡、腫瘤部位無關。結論結直腸癌中PDCD4和PAQR3 mRNA表達下降，二者無明顯相關性；PDCD4 和PAQR3 mRNA水平均與分化程度、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關，與性別、年齡、腫瘤部位無關。

關鍵詞〔〕結直腸癌;PDCD4;PAQR3

中圖分類號〔〕R735〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省科技計劃項目(132777248)；2015年度河北省醫學科學研究重點課題計劃項目(20150069)

1任丘市婦幼保健院2河北省淶源縣醫院

第一作者：李日恒(1972-)，男，博士，副主任醫師，主要從事胃腸外科疾病研究。

程序性細胞死亡因子(PDCD)4，是與細胞凋亡相關的抑癌基因，參與細胞的轉錄、翻譯及多種信號通路。已有研究顯示，PDCD4在結直腸癌、胃癌、肺癌、肝癌、腦膠質瘤等多種腫瘤組織中表達降低〔1，2〕。PAQR3是一種新的結直腸癌抑癌基因，參與了細胞的各種信號通路，影響能量代謝、細胞分裂增殖、分化以及生殖細胞成熟等生物學過程，能負性調控Ras/Raf/MEK/ERK信號通路。PAQR3也被證明在胃癌、乳腺癌等腫瘤組織中表達降低，PAQR3能增強乳腺癌細胞SK-BR-3對表柔比星的敏感性〔3〕。目前已被證實PAQR3在結直腸癌組織中發揮抑癌作用〔4〕。本文探討PDCD4、PAQR3mRNA轉錄水平與結直腸癌的關系，進一步指導結直腸癌診斷及治療。

1.材料與方法

1.1組織的提取54對結直腸癌組織、正常組織取自河北大學附屬醫院普通外科，收集標本時間為2013～2014年。納入標準：患者術前均未接受過放療、化療或免疫治療，收集癌組織標本時除外已發生壞死的腫瘤組織，癌旁正常組織取距癌組織邊緣>10cm的正常組織，組織取全層，診斷結果均由術后病理結果確定。男32例，女22例；直腸癌19例，結腸癌35例；年齡36～82歲，平均59.69歲。術中立即取標本放置于液氮中，并于-80℃冰箱內低溫保存，時間不超過6個月。

1.2主要應用試劑OmegaE.Z.N.A.TM總RNA提取試劑盒、VazymeHiscript第一鏈cDNA合成試劑盒、VazymeHiscriptqRTPCR熒光定量試劑盒、去RNA酶的EP管、槍頭、8聯排均購自石家莊市惠友生物科技有限公司，β-actin引物、PDCD4、PAQR3引物根據PrimerPremier5.0軟件設計合成，并通過PubmedBlast檢測其特異性，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。實驗中所需的無水乙醇、氯仿、瓊脂糖等試劑均由河北大學附屬醫院中心實驗室所提供。

1.3實驗方法

1.3.1組織RNA提取取約30mg的組織，根據OmegaE.Z.N.A.TM總RNA試劑盒說明書提取總RNA，取產物2μl于1%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外線下觀察并記錄結果，酶標儀檢測含量(2 000ng/μl)及比值(OD：1.9～2.0)合適后進行反轉錄，中途不能及時完成時將產物放置-20℃或-80℃低溫保存，保存時間不超過3個月。

1.3.2反轉錄根據RNA定量結果調整RNA總量，各取總RNA1μg，根據VazymeHiscript第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進行反轉錄，反應條件：25℃，5min；42℃，30min；85℃，5min，反應結束后產物進行分裝稀釋，放置于-20℃，保存時間不超過6個月，用以進行PCR反應。

1.3.3PCRPCR引物根據Primerpremier5.0設計，反應體系20μl，內參基因β-actin引物：5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’(正義)，5’-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3’(反義)，產物長度：302bp。PDCD4引物：5’-TGGGAGTGACGCCCTTAGAA-3’(正義)，5’-TCCACCTCCTCCACATCATACA-3’(反義)，產物長度 171bp；PAQR3引物：5’-TCTGTATGCTTTGCTCTGTGGG-3’(正義)，5’-TTTGCCATTGCTGCGTGAG-3’(反義)，產物長度252bp；反應條件：95℃，5min；95℃，10s；60℃，，32s，40個循環；95℃，15s；60℃ 60s，95℃ 15s。結果以β-actin進行校準。擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀下分析。

1.4統計學分析采用SPSS16.0軟件進行t、χ2檢驗和Spearman相關分析。

2結果

2.1結直腸癌組織中PAQR3 和PDCD4mRNA水平降低結直腸癌組織中PDCD4mRNA表達降低甚至不表達，表達降低率為35/54(64.8%)，表達水平：6.84±3.60，癌旁正常組織中mRNA為5.88±2.52，差異有統計學意義(P=0.036)。癌組織中PAQR3mRNA表達水平降低，甚至不表達，表達降低率為57.4%(31/54)，癌組織PAQR3mRNA的表達水平9.32±1.97，癌旁正常組織：8.44±2.42，差異有統計學意義(P=0.001)。二者無相關性(R=0.129，P=0.532)。

2.2PDCD4、PAQR3mRNA水平與結直腸癌臨床資料的關系結直腸癌組織中PDCD4 和PAQR3mRNA均與分化程度、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度有關，與性別、年齡、腫瘤部位無關。見表1。

表1　 PDCD4、 PAQR3 mRNA水平與結直腸癌

3討論

PDCD4的分布影響其作用發揮，它除了在發揮腫瘤細胞中發揮抑制轉錄、調節細胞周期及抑制轉移等作用，還能影響細胞類型的激活。在抑制轉錄方面，PDCD4蛋白能通過綁定eIF4A，直接抑制eIF4A結合到eIF4G，抑制eIF4A螺旋酶的活性，抑制轉錄起始；同時還能阻止P53與eIF4A的結合，抑制P53的表達，致其DNA損傷修復功能受損。此過程也影響細胞周期，能阻止G1向S、G2期進展〔4〕。在調節細胞增殖方面，不同細胞的PDCD4調節方式也不同，細胞類型的差異也影響PDCD4功能的發揮〔5～10〕。PDCD4敲除的結直腸癌HT-29細胞分化能力明顯增強，c-Jun磷酸化水平明顯提高，eIF4E、FLIP表達〔11〕。PDCD4能抑制JNK的活性，進一步抑制c-jun磷酸化，阻止eIF4E磷酸化，使金屬蛋白酶(MMP)-9和MMP-2表達降低，抑制細胞轉移；逆轉其磷酸化反應后，MMP-9和MMP-2表達增高，促進細胞轉移。

PDCD4mRNA在大腸癌中表達降低，表示PDCD4參與結直腸癌的形成，能作為結直腸癌的一種腫瘤標志物。Ferraro等〔12〕研究顯示，PDCD4mRNA低表達與淋巴結相關，能預測是否發生轉移，與本項研究分析結果一致。雖然各研究結果略有不同，但PDCD4mRNA水平檢測可以作為一種監測結直腸癌預后的輔助指標。

PAQR3競爭性結合于RAF，干擾RAF與下游信號分子、底物的結合〔13〕，感受細胞外信號、控制細胞增殖分化及存活，作用就是將胞外的刺激信號傳遞至胞內，達到調控細胞增殖、分化、凋亡及細胞惡性轉化、癌癥的發生、發展等生理過程的目的〔14〕。PAQR3基因沉默的機制仍不清楚。Wang等〔9〕檢測PAQR3mRNA在結直腸癌中表達降低率為82.3%(51/62)，與本研究結果有一定差異，而且他們提到在男性患者中PAQR3mRNA表達降低率較女性患者更高，這與結直腸癌在男性患者中比女性患者發病率高的流行病學分析結果一致〔15〕。且Wang等〔9〕發現結直腸癌組織中PAQR3mRNA水平與部位、年齡無關，與本研究的結果一致。

多種基因參與了結直腸癌的發生檢測相關基因、有利于結直腸癌的早期診斷。但單獨檢測某種基因特異性低、檢出診斷率下降，不利于結直腸癌的早期診斷。多個基因聯合檢測為結直腸癌的早期診斷提供了更充分的依據。

4參考文獻

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14WangX，LiXB，FanFJ，et al.PAQR3playsasuppressiveroleinthetumorigenesisofcolorectalcancers〔J〕.Carcinogenesis，2012;33(11)：2228-35.

15陳創奇，方樂堃，馬晉平，等.結直腸癌2042例臨床病理特點及預后回歸分析〔J〕.中華醫學雜志，2010;9(26)：1804-7.

〔2015-03-17修回〕

(編輯徐杰)