鋅指蛋白3在非小細胞肺癌中的表達

鋅指蛋白3在非小細胞肺癌中的表達

銀瑞董新偉王錚

(南陽市中心醫院胸外科，河南南陽473009)

摘要〔〕目的探討鋅指蛋白(ZBED)3在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達及與臨床病理資料的相關性。方法50對原發性肺癌及癌旁組織行免疫組化、熒光定量PCR檢測ZBED 3蛋白、mRNA的表達；12對新鮮肺癌及癌旁組織行Western印跡檢測ZBED 3蛋白的表達；統計學軟件分析不同臨床病理指標與ZBED 3表達的相關性。結果免疫組化實驗顯示ZBED 3表達定位于細胞質及少數細胞核，癌細胞中ZBED 3表達的陽性率顯著高于癌旁組織(P<0.05)；Western印跡試驗證實ZBED 3在肺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)；實時熒光定量PCR檢測肺癌組織mRNA表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)；ZBED 3在NSCLC中的表達與患者年齡、性別、腫瘤分化及組織學類型等無顯著相關性(P>0.05)，但與淋巴結轉移及TNM分期相關(P<0.05)。結論ZBED 3在NSCLC中過度表達，并與腫瘤的淋巴結轉移、TNM分期相關。

關鍵詞〔〕鋅指蛋白3；肺癌；Wnt通路

中圖分類號〔〕R734.2〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：銀瑞(1973-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事胸外科疾病的臨床診治和基礎研究。

Wnt通路在細胞的增殖、凋亡、癌變等過程中起重要作用，β-catenin在通路的調控中處于中心地位，且受Axin復合體調控。Axin是一個腫瘤抑制因子，在細胞增殖及癌變過程中起關鍵作用，但Axin的功能需通過其配體作用得以調節〔1〕。研究顯示，鋅指蛋白(ZBED)3是一種新的Axin結合蛋白〔2〕，據此推測ZBED3可通過Wnt信號通路參與機體的重要生理病理過程。本課題研究ZBED3在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達及其臨床意義。

1材料與方法

1.1材料50對原發性肺癌及癌旁組織來于南陽市中心醫院胸外科2012年6月至2014年6月手術切除標本。患者術前均未接受放、化療，年齡35～78歲，男35例，女15例。肺癌組織學分型及分級依據WHO2004版分類標準，其中鱗癌21例，腺癌29例；高分化12例，中分化20例，低分化18例；腫瘤臨床分期依據國際抗癌聯盟(UICC)2011年TNM分期標準：Ⅰ期8例，Ⅱ期20例，Ⅲ期21例，Ⅳ期1例。另取12對新鮮肺癌及癌旁組織快速冷凍于-70℃保存，用于Western印跡檢測。

1.2免疫組化檢測NSCLC及癌旁組織ZBED3的表達中性甲醛溶液固定肺癌及癌旁組織標本，石蠟包埋，連續切片，厚度為4μm，經脫蠟、脫苯、水化后，行抗ZBED3免疫組化染色，按鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法試劑盒說明書步驟進行。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，結果判定：ZBED3染色部位為細胞質，觀察染色強度(I)及范圍(S)，Ⅰ分為強、中及弱三個級別，棕黃色顆粒且深染為強表達(3分)，淡黃色無顆粒染為弱表達(1分)，中度表達介于二者之間(黃染顆粒狀、2分)；S≥10%為陽性，并分為0～4四個等級，其中<10%記為0分，代表陰性，10%≤S≤25%為1分，25%

1.3熒光實時定量PCR測定ZBED3mRNA的表達取等量肺癌及癌旁組織，采用Trizol法提取組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用熒光染料通過實時定量PCR方法檢測ZBED3mRNA的表達，引物序列：5′-ACTGGGCACGCCTGTTGG-3′和5′-CGGGGCTCTGCTTCTTTA-3′，β-actin為內參，引物序列：5′-GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′和5′-GATGTCACGCACGATTTC-3′，用2-△△Ct計算其相對表達量。

1.4Western印跡檢測NSCLC及癌旁組織ZBED3的表達取等量肺癌及癌旁組織，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑，4℃充分裂解30min，低溫12 000r/min離心35min，取上清，利用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度；每泳道加約60μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，經濕轉于聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，依次加入稀釋的抗ZBED3抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗并依次洗脫，加入化學發光試劑，化學發光成像系統進行成像檢測，利用QuantityOne軟件進行圖像灰度值分析，以各目的與內參條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達量。

1.5統計學方法應用SPSS13.0軟件進行χ2、t檢驗。

2結果

2.1在NSCLC及癌旁組織中ZBED3免疫組化及Western印跡結果免疫組化實驗顯示ZBED3表達定位于細胞質及少數細胞核，在癌細胞中ZBED3表達的陽性率為62%(31/50)，顯著高于癌旁組織10%(5/50)(P<0.05)。Western印跡試驗證實ZBED3在肺癌組織中的表達(60.8%±3.1%)顯著高于癌旁組織(20.3%±1.6%)(P<0.05)。

2.2ZBED3與臨床病理之間的相關性ZBED3在NSCLC中的表達與患者年齡、性別、腫瘤分化及組織學類型等無顯著相關性(P>0.05)，但與淋巴結轉移及TNM分期相關(P<0.05)。見表1。

表1　 ZBED 3與臨床病理參數之間的關系(n)

2.3在NSCLC及癌旁組織中ZBED3mRNA表達量NSCLCZBED3mRNA表達水平(1.021±0.001)明顯高于癌旁組織(0.104±0.002)(P<0.05)。

3討論

鋅指蛋白家族對DNA、蛋白質及RNA的識別和結合有一定的作用，ZBED3是鋅指結構域蛋白家族的一名成員〔2〕，含有鋅指的DNA結構域，可介導蛋白和DNA的結合，其基因位于人類第5號染色體上。人類ZBED3 蛋白由234個氨基酸組成，蛋白質分子量約為25kD〔3〕，利用基因芯片技術已發現ZBED3在人體組織中廣泛表達〔4〕。

Wnt信號通路是當今的研究熱點，參與細胞的調控、增殖、凋亡等〔1〕。Wnt信號通路是由Wnt蛋白及其受體、調節蛋白等組成的復雜信號傳導途徑，其異常激活與腫瘤侵襲轉移非常密切，主要由Wnt分子、Axin、GSK3β、β-catenin等組成〔5〕。β-catenin是Wnt通路正向調節的重要效應分子，在細胞質內降解失常，可在細胞核內累積激活一系列靶基因轉錄而形成腫瘤〔1〕。Axin為Wnt/β-catenin途徑的重要調節因子，可使細胞質中的β-catenin磷酸化及降解，從而負調節Wnt/β-catenin通路，Axin表達或功能喪失可能是惡性腫瘤增殖的重要因素之一〔2〕。Tamai等〔6〕在研究低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白(LRP)5、6的過程中，發現其能夠與Axin相互作用并抑制其活性，從而激活Wnt/β-catenin信號；Chen等〔7〕研究發現與LRP5、6功能相近的鋅指蛋白ZBED3與Axin結合后，抑制Axin介導的糖原合成酶激酶對β-鈣黏著蛋白的磷酸化并激活Wnt信號，促進腫瘤形成。

目前關于ZBED3在肺癌中的表達研究較少，本研究發現，相對于正常肺組織，ZBED3在NSCLC中過表達，并與腫瘤的淋巴結轉移、TNM分期相關，這提示ZBED3可能為維持NSCLC惡性表型的重要分子，并可能成為臨床治療的潛在靶點。

4參考文獻

1LoganCY，NusseR.TheWntsignalingpathwayindevelopmentanddisease〔J〕.AnnuRevCellDevBiol，2004；20(8)：781-810.

2PeastonAE，KnowlesBB，HutchisonKW.Genomeplasticityinthemouseoocyteandearlyembryo〔J〕.BiochemSocTrans，2007；35(3)：618-22.

3CuiT，ZhangP，GuoX，et al.TheexpressionandsignificanceofZincfingerproteinZBED3inmouseoocyte〔J〕.ActaUniversitatisMedicinalisNanjing(NaturalScience)，2011；31(9)：1-4.

4FanC，JiangGY，ZhangXP，et al.Zbed3contributestomalignantphenotypeoflungcancerviaregulatingβ-cateninandP120-catenin1〔J〕.MolCarcinog，2015;54(S1):E138-E147.

5PolakisP.Wntsignalingandcancer〔J〕.GenesDev，2000;14(15)：1837-51.

6TamaiK，SemenovM，KatoY，et al.LDL-receptor-relatedproteinsinWntsignaltransduction〔J〕.Nature，2000;407(6803)：530-5.

7ChenT，LiM，DingY，et al.Identificationofzinc-fingerBEDdomain-containing3 (Zbed3)asanovelAxin-interactingproteinthatactivatesWnt/β-cateninsignaling〔J〕.JBiolChem，2009;284(11)：6683-9.

〔2015-03-09修回〕

(編輯袁左鳴)