黑蘇嘎－25對腦缺血再灌注損傷模型大鼠血清腫瘤壞死因子－α、白細胞介素－1β表達的影響

黑蘇嘎-25對腦缺血再灌注損傷模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β表達的影響

佟淑平孫志剛杜聞博王洪軍李立飛田小東丁海東

(內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古通遼028000)

摘要〔〕目的探討黑蘇嘎-25對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制。方法取清潔級健康Wistar大鼠60只，分為假手術組、模型組、黑蘇嘎-25低、中、高劑量組，用藥組動物灌胃給藥7 d，制備局灶性腦缺血再灌注(MCAO)大鼠模型，通過行為學判斷神經功能缺損評分、組織病理學測定腦梗死面積、酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清中腫瘤細胞壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β水平。結果黑蘇嘎-25能減少MCAO大鼠的神經功能缺損評分及腦梗死的面積，降低局灶性腦缺血后血清TNF-α、IL-1β水平。結論黑蘇嘎-25對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其作用機制與降低血清TNF-α、IL-1β含量有關。

關鍵詞〔〕蒙藥；黑蘇嘎-25；腦缺血再灌注損傷

中圖分類號〔〕R74〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：內蒙古民族大學研究項目(NMD1184)

通訊作者：杜聞博(1981-),男,碩士，主要從事腦血管病學研究。

第一作者：佟淑平(1978-),女，碩士，主要從事肺間質性疾病研究。

缺血性腦血管病(ICVD)的防治一直是神經病學的難點和重點〔1，2〕，目前治療的關鍵是盡早溶栓治療恢復缺血腦細胞、組織血液灌流，一方面可挽救瀕臨死亡的腦細胞，但另一方面也會加重腦細胞損傷，導致腦細胞死亡，也就是說缺血后的血流再灌注在某些情況下會進一步導致細胞、組織損傷和功能障礙，造成腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷(CIRI)是由于血流再灌注后引起的繼發性損傷，是目前最受關注的問題之一〔3〕，越來越多學者研究關于CIRI機制中腦組織缺血后的炎癥反應〔4〕。因此通過各種有效措施阻斷腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β的表達可減少缺血性神經元損傷〔5〕。蒙藥黑蘇嘎-25主治脈病、偏癱、半身不遂等臨床療效顯著，主要成分有石決明、麝香、牛黃、木香、肉豆蔻、珍珠粉、犀角、沉香、蓽撥、肉桂、黑種子草、冬葵果、螃蟹、海金砂等，藥理具有良好的抗腦缺血損傷作用。黑蘇嘎-25成分是從天然產物中提取，具有副作用小且作用多途徑、多靶點，可針對腦缺血性變化的多個環節。本文探討黑蘇嘎-25對實驗性大鼠CIRI的保護作用及機制。

1材料與方法

1.1動物、主要藥品、試劑及儀器選用健康雄性Wistar大鼠60只，體重約(230±20)g，長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證號碼：SCXK(吉)-2011-0004。大鼠飼養于適宜溫度及濕度的動物室中，處于相同飼養環境且自由攝食和飲水，自然晝夜(術前12 h禁食水)。黑蘇嘎-25 (0.2 g/粒，內蒙古民族大學附屬醫院制劑室生產)；TNF-α試劑盒、IL-1β試劑盒(上海麗臣生物科技有限公司，美國進口分裝)；紅四氮唑(TTC)：天津市福晨化學試劑廠；水合氯醛：青島宇龍海藻有限公司。手術顯微鏡(吉祥鳥牌，江蘇鎮江中文光學儀器有限責任公司)；全自動多功能酶標儀(MULTISKANMK3，wELLWASH4MKZ芬蘭)；醫用圖像分析系統(BI-2000成都泰盟科技有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組60只健康雄性Wistar大鼠，隨機分成五組，每組12只。假手術組：假手術+生理鹽水灌胃；模型組：缺血再灌注+生理鹽水灌胃； 治療組高、中、低劑量黑蘇嘎-25組：缺血再灌注+高、中、低劑量黑蘇嘎-25灌胃。

1.2.2給藥方法假手術組：生理鹽水5 ml·kg-1·d-1；模型組：生理鹽水5ml·kg-1·d-1；高、中、低劑量黑蘇嘎-25組：360、180、90 mg·kg-1·d-1，溶于和假手術組等體積的生理鹽水，用前搖勻。灌胃給藥，每天1次，連續7 d。

1.2.3CIRI模型的制備模型組與用藥組Wistar大鼠于最后1次灌胃后2 h參照Longa等〔6〕的改良的線栓法制備大腦中動脈栓塞(MCAO)模型：用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定，用醫用碘伏消毒頸前部，在頸正中行長約2 cm切口，鈍性分離，暴露左側頸總動脈(CCA)和分叉部，分離分叉處的頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，分離ECA分支枕動脈、甲狀腺上動脈，依次結扎CCA近心端、支枕動脈、甲狀腺上動脈，并在遠心端剪斷枕動脈、甲狀腺上動脈，在甲狀腺上動脈分支之后結扎頸外動脈近心端和遠心端，自中間剪斷。拉直近心端剪斷的ECA，使ECA與ICA處于同一直線上，微動脈夾暫時性夾閉ICA遠心端，于ECA距CCA分叉5 mm處附近，在ECA剪一“V”口，將線栓向頸內動脈顱方向插入16～18 mm(線栓直徑0.24 mm，頭端0.30 mm)注意不要誤入翼腭動脈，可感到阻力而無法向前推進時停止，將線栓固定在ECA上，縫合手術切口，栓線尾部伸出皮下1 cm左右便于拔栓線，缺血2 h后，外拉栓線0.5 cm，從而實現24 h再灌注。假手術組僅暴露左側頸總動脈，其余不做任何處理。模型成功的標志是大鼠左眼出現Horner征；提尾時右前肢內收屈曲；爬行時向右側傾倒或按順時針方向轉圈，不成功者予以剔除，并隨機補充。

1.2.4標本的收集與處理假手術組在手術后2 h，其余各組模型制備成功后，再達到各自再灌注時間點24 h時，經10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，打開胸腔，腹主動脈取血5 ml后，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛各200 ml進行左心室灌流固定，至流液透明，斷頭取腦，行TTC染色，測定腦梗死體積。

1.2.5神經功能缺損評分參照Longa等〔6〕的5分制評分標準對麻醉蘇醒后的大鼠進行神經功能缺損評分。造模成功的判定標準：以大鼠手術麻醉清醒后出現右側肢體癱瘓，站立不穩，提尾時向一側轉圈為模型成功的判斷標準。0分、4分或死亡剔除，再隨機補充。

1.2.6腦梗死體積測定(TTC染色法)假手術組在術后2 h，其余各組在模型制備成功后，達到各再灌注時間點24 h時，每組大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內注射深度麻醉，腹主動脈取血5 ml后，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛各200 ml進行左心室灌流固定，至流液透明，迅速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，其余用排刀冠狀切成8片，每片厚度約2 mm，置于2%TTC溶液中，37℃電熱恒溫培養箱避光染色30 min，4%多聚甲醛液中固定24 h后數碼相機照片后，用醫用圖像分析系統(BI-2000成都泰盟科技有限公司)處理照片，測量腦梗死面積，計算腦梗死體積比，其與全腦體積之比為梗死體積百分比。

1.2.7血清TNF-α、IL-1β水平的表達假手術組在術后2 h，其余各組在模型制備成功后，達到各再灌注時間點24 h時，每組大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內注射深度麻醉，腹主動脈取血5 ml，在4℃冰箱內沉淀24 h后，3 000 r/min離心10 min留取上清液，-80℃低溫冰箱保存備用。根據試劑盒說明書用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平。

1.3統計學處理采用SPSS11.0軟件進行Wilcoxon秩和檢驗法及單因素方差分析。

2結果

2.1腦缺血再灌注后神經功能缺損評分腦缺血2 h，再灌注24 h后，大鼠神經功能缺損癥狀主要表現為提尾時右前肢內屈曲收，肌力、肌張力降低，側推阻力降低，活動減少，向右側追尾轉圈，伴或不伴有左側Horner征。假手術組無神經功能缺損癥狀，評分均為0分；與假手術組相比，模型組及黑蘇嘎-25治療組均有明顯的神經功能缺損癥狀(P<0.05)；與模型組相比，黑蘇嘎-25低、中、高劑量組神經功能缺損程度均有所減輕，并隨著藥物劑量的增加，神經功能缺損評分減少，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(P<0.05)。見表1。

2.2黑蘇嘎-25對大鼠CIRI腦梗死體積的影響假手術組腦組織呈均勻紅色無梗死灶；模型組和黑蘇嘎-25組可見梗死蒼白區域位右側額頂葉皮質下部和紋狀體外側區。與假手術組相比，模型組及黑蘇嘎-25高、中、低劑量組均有明顯的白色梗死灶(P<0.05)；與模型組相比，黑蘇嘎-25各劑量均使梗死灶體積減小，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(P<0.05)。見表1。

2.3黑蘇嘎-25對大鼠CIRI血清TNF-α水平的影響與假手術組相比，模型組及黑蘇嘎-25各劑量組血清TNF-α水平的表達明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，黑蘇嘎-25各劑量組均使血清TNF-α水平降低，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(P<0.05)。見表2。

2.4黑蘇嘎-25對大鼠CIRI損傷血清中IL-1β的影響與假手術組相比，模型組及黑蘇嘎-25各劑量組血清中IL-1β水平的表達明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，黑蘇嘎-25各劑量均使血清中IL-1β水平的表達降低，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(P<0.05)。見表2。

表1　腦缺血再灌注后神經功能缺損評分及

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2　腦缺血再灌注后血清TNF-α、IL-1β水平的

3討論

溶栓、抗血小板和抗凝治療后，在血流復通實施再灌注的同時，又會在某些情況下(如炎癥反應)加重已缺血細胞、組織的進一步損傷〔7〕。通過藥物干預等方法減輕這種損傷程度，可達到較為理想的治療目的。本實驗研究結果顯示，模型組在缺血2 h，再灌注24 h后，形成了再灌注損傷，表現為出現神經功能缺損癥狀，腦組織出現梗死灶及血清TNF-α、IL-1β水平升高；黑蘇嘎-25治療后，神經功能缺損有所減輕，梗死灶體積縮小，血清TNF-α、IL-1β水平降低，達到了藥物干預的保護作用。蒙藥民間有許多成方可以治療缺血性腦血管疾病，但蒙醫臨床上最常用的只有三種：珍寶丸、扎沖十三味和黑蘇噶-25，這三種藥中黑蘇噶-25研究的最少，可能與藥物成分多，利用現代工藝難以提取有效成分，而且價格昂貴有關。參照《中國藥典》2005年版，蒙藥黑蘇嘎-25，性味咸寒，具有解毒，愈傷，除協日烏素，清腦退翳，主治白脈病，中風，偏癱、半身不遂腦傷，協日烏素病，眼翳白斑，骨折，創傷，頸強等功效〔8〕。本實驗通過藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算表，根據人的用藥劑量換算出Wistar大鼠的用藥劑量。

研究表明腦缺血早期TNF-α的表達迅速增加是腦梗死形成的主要原因〔9〕，郭順華等〔10〕用Northern印跡方法觀察到在缺血后1 h缺血側神經元即有TNF-α mRNA的表達，24 h達高峰。本實驗結果提示腦缺血再灌注過程中TNF-α的水平增加；黑蘇嘎-25能減少血清TNF-α的水平，對腦缺血再灌注后的損傷具有腦保護作用。IL-1β導致血栓形成，誘導小膠質細胞釋放細胞因子、自由基等促進腦缺血后炎癥介質的損傷作用，引起神經元損傷。IL-1β還能增加細胞間黏附分子(ICAM)-1在腦缺血中的表達水平。ICAM-1可使介導白細胞和內皮細胞的緊密黏附，阻塞微血管，降低腦血流。

本研究顯示黑蘇嘎-25的應用明顯改善了腦缺血的神經損傷程度及減少了腦梗死灶體積，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，可能是抑制了TNF-α及IL-1β活性而產生明顯的神經保護作用〔5〕，從而減輕腦缺血再灌注所造成的神經功能損傷。因以上用藥劑量是根據人的用藥劑量換算出Wistar大鼠的用藥劑量，并以此標準確定為大鼠用藥的中劑量治療組，如果把此標準確定為低劑量治療組，也就是說增加用藥劑量，其治療效果有待進一步研究。

綜上，本研究表明黑蘇嘎-25能夠減少局灶性腦缺血大鼠的神經功能缺損評分及縮小局灶性腦缺血大鼠的腦梗死面積，降低局灶性腦缺血后血清TNF-α、IL-1β水平，抑制TNF-α、IL-1β的表達，可能參與了黑蘇嘎-25對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦保護作用。

4參考文獻

1游然，幸敏麗，沈海滔，等.缺血性腦血管疾病的發病機制及治療藥物〔J〕.醫學進展，2009；33(6)：247-53.

2朱晉，仲駿.腦缺血再灌注損傷的研究進展〔J〕.國際神經病學神經外科學雜志，2008；35(1)：46-50.

3蔡世昌，白波，張秋玲.腦缺血再灌注后神經細胞再生研究進展〔J〕.解剖學研究，2012；34(1)：54-7.

4Chen B，Liao WQ，Xu N，etal.Adiponectin protects against cerebral ischemia reperfusion injury through antiinflammatory action〔J〕.Brain Res，2009；1273(4)：129-37.

5梁健芬，董少龍，竇維華，等.水蛭注射液對大鼠腦缺血再灌注后TNF-α、IL-1β和ICAM-1蛋白表達的影響[J].陜西醫學雜志，2006；35(12)：1605.

6Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

7Xu Z，Xu RX，Liu BS，etal.Time window characteristics of cultured rat hippocampal rat hippocampal neurons subjected to ischemia and reperfusion〔J〕.Chin J Traumatol， 2005；8(3)：179-82.

8國家中醫藥管理局中華本草編委會.中華本草·蒙藥卷〔M〕.上海：上海科學技術出版社，2002：429.

9劉一鷗，金便芬，張林靜，等.腦梗死患者血漿脂聯素和腫瘤壞死因子-α與病情輕重的關系〔J〕.中國全科醫學，2007；10(20)：1681.

10郭順華，丁潔，楊霽云.中國Alport綜合征臨床特點與研究現狀〔J〕.腎臟病與透析腎移植雜志，1999；8(1)：71-3.

〔2014-01-15修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)