廣西壯族長壽群體白細胞端粒長度與TERC基因變異的相關性

廣西壯族長壽群體白細胞端粒長度與TERC基因變異的相關性

黎海燕1羅曉秋劉承武王藝苑吳華裕2葛琳彭均華潘尚領

(廣西醫科大學病理生理學教研室，廣西南寧530021)

摘要〔〕目的探討廣西壯族長壽群體白細胞端粒長度與端粒酶基因hTERC多態性的相關性。方法采用TaqMan MGB探針檢測廣西壯族長壽群體TERC基因位點(rs12696304、rs16847897和rs3772190)多態性，并與其第一代子女組及同地區普通人群即對照相比較，同時分析其與白細胞端粒長度(LTL)的相關性。結果(1)rs12696304、rs16847897及rs3772190的基因型頻率在三個組間的分布無差異，P值分別為0.83、0.33和1.00；等位基因頻率在三個組間也是相似的，P值分別為0.70、0.83和0.98；三個位點的最小等位基因分別是C、G和G。(2)TERC基因三個位點的不同基因型之間的LTL在總人群、長壽組及子女組均無明顯差異，對照組在位點rs3772190，GA基因型LTL最長，其次為GG基因型，AA基因型LTL最短，P=0.02。(3)建立LTL的多元線性回歸方程，總人群中顯示LTL與年齡是明顯相關的，但與TERC基因位點的各基因型并不相關。結論TERC基因多態性對廣西壯族長壽群體LTL無明顯影響。

關鍵詞〔〕端粒酶基因；端粒長度；長壽

中圖分類號〔〕R339.36〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81360066)，廣西自然科學

通訊作者：潘尚領(1965-)，男，博士，教授，主要從事衰老與長壽遺傳學研究。

1南寧輸血醫學研究所

2廣西醫科大學細胞生物學與遺傳學教研室

第一作者：黎海燕(1978-)，女，在讀博士，助理研究員，主要從事衰老與長壽遺傳學及輸血研究。

Study on the association between leukocyte telomere length and genetic variants on TERC gene of Guangxi Zhuang longevity population

LI Hai-Yan, LUO Xiao-Qiu, LIU Cheng-Wu,etal.

Department of Pathophysiology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the potential relationship between polymorphism of TERC and leukocyte telomere length(LTL) in Guangxi Zhuang longevity population.MethodsGenotyping of TERC SNPs (rs12696304, rs16847897and rs3772190) were performed with TaqMan MGB for the members from longevity population (longevity group, n=485), and their polymorphism were compared with their offspring population (offspring group, n=627), and controls without a familial history of exceptional longevity in the same area(control group, n=218); at the same time the possible association between TERC genotypes and LTL in three groups were evaluated.Results(1) Genotypic frequencies of SNP rs12696304 , rs16847897 and rs3772190 between the three groups were similar (P=0.83, 0.33 and 1.00, respectively); the allelic frequencies among the three groups also showed no significant difference (P=0.70, 0.83 and 0.98, respectively); the minor alleles were C, G and G. (2) Between different genotypes of three loci of TERC, LTL showed no difference among the three groups; but in control group, the LTL of G carriers of rs3772190 (GG/GA) was significantly longer than AA genotype carriers. (3) Multiple linear regression analysis showed that LTL significantly correlated with age, but not with the genotypes of three TERC loci.ConclusionsThere is no obvious correlation between TERC polymorphism and LTL in Guangxi Zhuang longevity population.

【Key words】TERC; Telomere length; Longevity

端粒酶是一種特殊的核蛋白反轉錄酶復合體，負責端粒DNA重復序列的再合成，確保端粒的正常修復和端粒長度(TL)的維持，由端粒酶RNA元件(hTERC)、端粒酶反轉錄酶(hTERT)及端粒酶相關蛋白等組成〔1〕。端粒酶活性主要取決于這兩個亞單位，其中hTERC為非編碼的RNA，在端粒合成時提供模板序列，hTERT為125 kD的單鏈多肽，在端粒合成時起催化作用〔2〕。端粒與衰老關系密切，TL隨年齡增加而逐漸縮短在許多研究中已經得到證實〔3,4〕，近年已逐步成為人類衰老重要的生物學標記之一。端粒酶是TL的主要調控因素之一，那么端粒酶基因的突變是否會影響TL？本課題組的前期研究發現白細胞TL(LTL)在壯族長壽群體中有一定的遺傳傾向〔5〕。本研究擬通過對廣西壯族長壽群體的端粒酶TERC基因常見變異的三個多態位點(rs12696304、rs16847897和rs3772190)進行基因型檢測，了解三個組間這些位點的基因型及等位基因的頻率分布情況，并分析其與LTL的相關性，以探討TERC基因多態性對LTL的影響。

1材料與方法

1.1研究對象及標本的采集長壽組主要為廣西地區(包括東蘭、鳳山、都安、巴馬及平果縣)的壯族≥90歲的長壽老人，共485人，其中男117人，女368人，平均年齡(93.17±3.02)歲；子女組為長壽老人的第一個子或女，共627人，其中男477人，女150人，平均年齡(57.75±7.80)歲；對照組為同地區的普通人群，其家族史中沒出現過≥90歲的老人，且與長壽老人無任何的血緣關系，共218人，其中男121人，女97人，平均年齡(64.63±10.15)歲。根據“知情同意”原則采集研究人群的血樣，用經典苯酚/氯仿法提取基因組DNA。所有對象在采樣前均接受問診及體格檢查及認知、自理能力的測試，基本排除糖尿病、心腦血管病變及老年癡呆等相關疾病。

1.2研究方法

1.2.1LTL的測定采用實時熒光定量PCR對外周血白細胞相對TL進行測定，端粒的引物：上游：5′ ACACTAAGGTTTG GGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT3′，下游：5′TGTTAGGTAT CCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA 3′；內參36B4基因的引物：上游：5′CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC 3′，下游：5′ CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA 3′，具體方法參照文獻〔5〕。

1.2.2TERC基因三個位點基因型的檢測針對TERC基因三個位點rs12696304、rs16847897及rs3772190的核酸序列設計TaqMan探針，采用FAM及VIC熒光標記的兩種報告基團，聚合酶鏈反應(PCR)體系包含：TaqMan Universal PCR Master Mix 5 μl、引物/探針0.7 μl、DNA 1 μl、ddH2O 3.3 μl，總反應體積10 μl。擴增條件：預變性95℃ 10 min；變性92℃ 15 s，退火60℃ 1 min，共40個循環。用ABI 7500 Real Time PCR System分析檢測結果。隨機抽取所有樣品的5%進行重復檢驗作為質控，空白對照以雙蒸水代替樣本DNA，余成份相同。

1.3統計學方法采用PASW Statistics 18.0軟件，采用擬合優度分析研究對象的Hardy-Weinberg平衡，χ2檢驗比較基因型及等位基因的頻率。經檢驗LTL基本呈正態分布，采用協方差分析消除年齡的影響比較各組不同性別或基因型之間的LTL，多元線性回歸建立影響LTL各因素的回歸方程。

2結果

2.1H-W平衡檢驗經擬合優度分析，TERC基因位點rs12696304、rs16847897和rs3772190均符合H-W平衡(P>0.05)，因此樣本具有一定的群體代表性。

2.2不同分層下各組的LTL情況總體上三個組間LTL的比較并無顯著性差異，性別分層后，同性別三個組間LTL的比較亦無顯著性差異，同一組內不同性別間LTL的比較，顯示對照組中女性LTL長于男性，P=0.01，而該趨勢在長壽組及子女組中并不存在，P分別為0.71和0.07。見表1。

2.3組間基因型及等位基因頻率的比較位點rs12696304、rs16847897及rs3772190的基因型頻率在三個組之間分布相似，P值分別為0.83、0.33和1.00；等位基因頻率在三個組間也無顯著性差異，P值分別為0.70、0.83和0.98；三個位點最小等位基因分別為C、G和G。見表2。

表1　不同分層下各組的

表2　三個組間基因型及等位基因頻率的比較〔 n(%)〕

表3　rs12696304位點TERC基因型對LTL的影響 ± s)

表4　rs16847897位點TERC基因型對LTL的影響 ± s)

表5　rs3772190位點TERC基因型對LTL的影響 ± s)

2.4TERC基因型對LTL的影響見表3~表5。以年齡為協變量，用協方差分析比較各組不同基因型之間的LTL?？側巳骸㈤L壽組及子女組顯示TERC基因的每個檢測位點的基因型之間的LTL無區別。對照組在位點rs3772190 GA基因型LTL最長，其次為GG基因型，AA基因型LTL最短，P值為0.02。

2.5基因型與LTL的線性關系對年齡及各基因型建立LTL的多元線性回歸方程，年齡與LTL有明顯的回歸關系，未標準化系數(β)為-0.003，P值為0.000，但TERC位點各基因型與LTL未存在線性關系。見表6。

表6　總人群LTL與各影響因素的線性相關性

3討論

TL與衰老關系密切，一般的規律是年齡越大TL越短，它們之間是負相關的關系，本研究結果顯示，廣西壯族群體LTL與年齡也呈現明顯的負相關，支持了這個觀點。編碼hTERC的基因位于3q26.3〔6〕，TERC基因常見多態性位點為rs3772190、rs12696304、rs10936599及rs16847897等〔4,7〕。文獻報道，TERC基因突變可以導致TL的縮短，Shen等〔8〕研究結果表明：在中國漢族人群中TERC基因的多態性位點rs12696304和rs16847897與LTL呈明顯相關性，rs12696304(G)和rs16847897(C)的個體具有相對較短的LTL。很多疾病如骨髓造血障礙、先天角化不良等被發現與TERC基因突變及TL的縮短相關聯〔9〕，Sheng等〔10〕用GWAS確定TL與TERC位點(rs12696304和rs16847897)有關聯，與第一四分位數(最短)的TL相比，第二和第三個四分位數的TL可能發生急性淋巴細胞性白血病的風險較低，此外，與CC基因型比較，rs16847897 CG基因型患急性淋巴細胞性白血病的風險率增加29%。長壽與TL和TERC基因突變也有一定的相關性，Soerensen等〔4〕研究發現丹麥人中rs3772190(A)及rs12696304(G)的男性其LTL較短，而與長壽有關的位點是rs3772190。但是，也有TL與TERC基因多態性并不相關的報道：Maubaret等〔11〕發現TERC基因rs12696304 G、rs10936601 T和rs16847897 C組成的單倍型GTC與低風險的冠心病和Ⅱ型糖尿病患病率是相關的，但該單倍型對LTL并無影響。

廣西壯族自治區長壽老人較多，特別是巴馬縣及其所在的紅水河流域包括東蘭、鳳山、都安等縣的長壽老人眾多，是著名的長壽之鄉〔12〕。本文中對這些地區及周邊的平果縣長壽群體進行LTL的測定，推測，長壽群體及其子女理論上應該是LTL較長，而對照組LTL較短，而結果顯示，LTL在三個組間并無差異，區分性別后LTL在三個組間的比較亦無差異，僅在組內比較時發現對照組女性LTL長于男性，表明長壽組雖然年紀較大，但其LTL仍與其子女或周圍的普通老年人相當，因此探討TERC基因的多態性是否可以解釋長壽老人較長LTL的機制。

在不同民族和地區間，TERC等位基因頻率差異很大，Prescott等〔13〕報道英國和加拿大的群體，rs12696304最小等位基因為G，頻率分別為0.26和0.27，rs16847897最小等位基因為C，頻率分別為0.26和0.28，rs3772190最小等位基因為A，頻率為0.25，并發現rs16847897最小等位基因C與LTL的對數成負相關的關系。中國漢族報道rs12696304和rs16847897 MAF分別是C(0.32)、G(0.39)〔9〕，和本研究的廣西壯族群體頻率相近。在位點rs3772190中，G等位基因攜帶者LTL較長，AA基因型LTL最短，因此，該位點在對照組G>A的變異可能為不利變異。LTL與年齡相關聯，這個結果和Benetos等〔14〕的報道是一致。

綜上所述，本研究考慮除TL的變化對衰老的影響外，長壽的獲得可能還有其他因素的影響。總之，長壽是一個復雜的表型，TL的使用給我們提供了一個研究老年疾病的新維度〔14〕，其更深的機制有待進一步的研究。

參考文獻4

1Eid MM，Helmy NA，Omar IM，etal.Clinical significance of telomerase genes (hTERC and hTERT) amplification in patients with acute myeloid leukemia〔J〕.Gulf J Oncolog，2013；1(13)：51-60.

2Vidale P，Magnani E，Nergadze SG，etal.The catalytic and the RNA subunits of human elomerase are required to immortalize equid primary fibroblasts〔J〕.Chromosoma，2012；121(5)：475-88.

3Liu Y，Cao L，Li Z，etal.A genome-wide association study identifies a locus on TERT for mean telomere length in Han Chinese〔J〕.PLoS One，2014；9(1)：e85043.

4Soerensen M，Thinggaard M，Nygaard M，etal.Genetic variation in TERT and TERC and human leukocyte telomere length and longevity：a cross-sectional and longitudinal analysis〔J〕.Aging Cell，2012；11(2)：223-7.

5羅曉秋，吳華裕，劉承武，等.巴馬地區壯族人群口腔黏膜細胞端粒的長度〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(1)：17-20.

6Simonsen JL，Rosada C，Serakinci N，etal.Telomerase expression extends the proliferative life-span and maintains the osteogenie potential of human bone marrow stromal cells〔J〕.Nat Biotechnol，2002;20(6)：592-6.

7Atzmon G，Cho M，Cawthon RM，etal.Evolution in health and medicine Sackler colloquium：Genetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2010;107 (Suppl 1)：1710-7.

8Shen Q，Zhang Z，Yu L，etal.Common variants near TERC are associated with leukocyte telomere length in the Chinese Han population〔J〕.Eur J Hum Genet，2011;19(6)：721-3.

9Trudeau MA，Wong JM.Genetic variations in telomere maintenance，with implications on tissue renewal capacity and chronic disease pathologies〔J〕.Curr Pharmacogenom Person Med，2010;8(1)：7-24.

10Sheng X，Zhang L，Luo D，etal.A common variant near TERC and telomere length are associated with susceptibility to childhood acute lymphoblastic leukemia in Chinese〔J〕.Leuk Lymphoma，2012;53(9)：1688-92.

11Maubaret CG，Salpea KD，Romanoski CE，etal.Association of TERC and OBFC1 haplotypes with mean leukocyte telomere length and risk for coronary heart disease〔J〕.PLoS One，2013;8(12)：e83122.

12Pan SL，Wang F，Lu ZP，etal.Cholesteryl ester transfer protein TaqIB polymorphism and its association with serum lipid levels and longevity in Chinese Bama Zhuang population〔J〕.Lipids Health Dis，2012;11：26.

13Prescott J，Kraft P，Chasman DI，etal.Genome-wide association study of relative telomere length〔J〕.PLoS One，2011;6(5):019635.

14Benetos A，Okuda K，Lajemi M，etal.Telomere length as an indicator of biological aging：the gender effect and relation with pulse pressure and pulse wave velocity〔J〕.Hypertension，2001;37(2 Pt 2)：381-5.

〔2014-07-04修回〕

(編輯袁左鳴)