體外轉染Klotho基因對原代成骨細胞活性的影響

體外轉染Klotho基因對原代成骨細胞活性的影響

楊秋晨馬厚勛李運奎鄧小琴唐蕓吳平

(重慶醫科大學附屬第一醫院老年病科,重慶400016)

摘要〔〕目的探討轉染克老素(KL)基因對成骨細胞活性的影響。方法提取原代骨髓間充質干細胞(BMSCs)并培養，用倒置顯微鏡觀察BMSCs形態。BMSCs培養至第三代時做流式鑒定，之后換為誘導培養基培養14~21 d，誘導為成骨細胞，用茜素紅染色鑒定是否誘導成功。通過重組腺相關病毒(rAAV)介導小鼠KL基因轉染成骨細胞。實驗分為五組：空白對照組(control組)，KL轉染組(KL組)，klotho轉染+FGFR1抑制劑(BGJ398)組(KL+ BGJ398組)，空載體組(rAAV組)，空載體+FGFR1抑制劑(BGJ398)組(rAAV+BGJ398組)。分組處理72 h后，熒光倒置顯微鏡觀察成骨細胞腺病毒表達情況，RT-PCR檢測成骨細胞的 KL mRNA 的表達，ELISA檢測上清液 KL 蛋白的含量；RT-PCR檢測成骨細胞分泌物：骨鈣素(OCN)、 骨橋蛋白(OPN)的mRNA表達。結果成功提取原代骨髓間充質干細胞，并且成功向成骨方向誘導。通過rAAV轉染KL后，成骨細胞高表達外源性KL蛋白(P<0.01)，并在KL-FGF23-FGFR1通路正常的情況下可顯著促進成骨細胞分泌OCN(P<0.05)，顯著抑制成骨細胞分泌OPN(P<0.05)。結論KL可以促進成骨細胞的活力，可能是通過KL-FGF23-FGFR1通路發揮作用。

關鍵詞〔〕成骨細胞;klotho;骨鈣素;骨橋蛋白

中圖分類號〔〕R592〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金面上項目(No.30672212)；重慶市衛生局醫學科研計劃項目(No.20B-2-029)；國家臨床重點專科建設項目(國衛辦醫函〔2013〕544號)

通訊作者：馬厚勛(1966-)，男，教授，主任醫師，主要從事老年心血管病基礎與臨床研究。

The effect of klotho gene transfection on the vitality of primary osteoblasts

YANG Qiu-Chen,MA Hou-Xun,LI Yun-Kui,etal.

Department of Gerontics,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of klotho(KL) gene transfection on the vitality of primary osteoblasts,and to reveal the effect of KL via fibroblast growth factor(FGF)-23 signal path on bone metabolism.MethodsThe primary mesenchymal stem cells (BMSCs) were abstracted from male rats.The morphologies of BMSCs was observed by inverted microscope.After the third generation culture,the specific surface markers of them were identified by flow cytometer.Then BMSCs were cultured by conditioned medium particularly for inducing into osteoblasts for 14~21 days.Alizarin red staining was used to test whether the induction was successful.After successfully inducted,the primary osteoblasts were transfected by adeno associated virus mouse KL gene(rAAV/kL).The experiment was divided into control ,KL,KL with BGJ398(FGFR1 inhibitor) ,adenovirus empty vector,adenovirus empty vector with BGJ398(FGFR1 inhibitor) groups.After treatments,the expression of KL in osteoblasts was detected by RT-PCR,inversed fluorescent microscope and ELISA.The expression of osteoblast discharges: osteopontin (OPN),osteocalcin(OCN) were detected by RT-PCR.ResultsBMSCs were successfully abstracted from rats,and also primary osteoblasts were inducted.After transfected ,the exogenous KL -derived genes were highly expressed (P<0.01).KL improved discharge of OCN(P<0.05) and inhibited OPN(P<0.05) in osteoblasts when KL-FGF23-FGFR1 pathway was normal.ConclusionsKL could promote the vitality of primary osteoblast probably through KL-FGF23-FGFR1 pathway.

【Key words】Osteoblasts;klotho;Osteopontin;Osteocalcin

第一作者：楊秋晨(1988-),女，碩士，主要從事老年心血管疾病的基礎與臨床研究。

克老素(KL)基因突變與人類多種衰老表型相關，其中包括骨質疏松〔1〕。研究發現在培養來自KL缺陷小鼠的成骨細胞時，其成骨細胞增殖正常但其堿性磷酸酶活性減低，礦化的基質形成顯著減少〔2〕。KL蛋白在成纖維生長因子(FGF)23信號轉導中，作為成纖維細胞生長因子受體(FGFR)1的輔助因子形成KL-FGF23-FGFR1形式，共同參與對鈣、磷穩態的調節〔3〕。本課題組在前期研究中應用攜帶小鼠KL基因的腺相關病毒載體(rAAV/KL)作用于去勢大鼠骨質疏松模型，發現KL表達上調可以明顯減緩骨質疏松的病情并改善骨質疏松骨微結構的破壞程度〔4〕。本文推測KL在原發性骨質疏松發生、發展中起重要作用，但其細胞及分子層面的具體機制國內外鮮有報道。本文擬在細胞水平探索klotho刺激成骨細胞因子分泌的能力，揭示KL經FGF23 信號通路對骨代謝調節的分子機制。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器四周齡左右的SD雄性大鼠10只，由重慶醫科大學動物實驗中心提供(實驗過程按照動物倫理學要求處置動物〔5〕)；DMEM/F12細胞培養基、胎牛血清為Hyclone公司產品；胰蛋白酶、PBS購于博士德生物公司；RNAiso Plus試劑、PrimeScript RT reagent 試劑盒、Premix TaqTM試劑、DL500DNA Maker購于大連寶生物公司；PCR引物由上海生工生物有限公司提供；DEPC購于Sigma公司；FGFR1抑制劑BGJ398(Selleckchem公司)；小鼠KL ELISA試劑盒購于北京博奧森生物公司；4%多聚甲醛(含DEPC)為博士德生物公司產品；SD大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)成骨誘導分化培養基和茜素紅染色試劑(cyagen公司)；Anti-Rat CD45 PE、Anti-Rat CD90.1 PE、Anti-Rat CD44H PE均購于eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1攜帶小鼠KL基因的rAAV/KL及帶有熒光的重組腺空載體病毒(rAAV/GFP)的構建由本課題組前期完成，參照文獻〔4〕。

1.2.2BMSCs的分離、培養SD大鼠采用10%水合氯醛(2 ml/kg)腹腔注射麻醉，0.5%無菌碘伏擦拭大鼠全身，無菌條件下剪開大鼠皮膚，分離肌肉，取雙側股骨和脛骨，用無菌紗布除去骨表面的附著組織(骨膜、肌肉)，置于無菌PBS中。用剪刀剪斷股骨和脛骨中段，暴露骨髓腔。用10 ml無菌注射器從骨的斷端注入0.9%無菌生理鹽水反復沖洗骨髓腔。將收集的骨髓液置于無菌10 ml玻璃離心管中。1 500 r/min，10 min離心后用 4~5 ml DMEM/F12培養液(含體積分數10%的胎牛血清)吹勻細胞,重懸。將細胞用25 cm2無菌塑料培養瓶均勻收集。然后置于溫度37℃、CO2飽和度為5%的恒溫細胞培養箱中繼續培養。72 h后首次全量換液，之后每3 d全量換液1次。當倒置顯微鏡觀察細胞密度達到85%左右時,用0.25%無菌胰蛋白酶37℃消化5 min，鏡下觀察約80%細胞變圓形后用新鮮培養基終止消化，1 000 r/min、3 min離心后，輕柔吹打使之成為單細胞懸液，然后按1∶2比例傳代培養。顯微鏡下觀察BMSCs形態。

1.2.3流式細胞術鑒定BMSCs將BMSCs培養至第三代，觀察細胞密度達85%時消化成單細胞懸液，分裝置EP管中。用預冷PBS清洗3次，各EP管分別加入CD44、CD45、CD90抗體3 μl，并設立同型陰性對照。冰上孵育40 min后，用預冷PBS清洗3次，最后加入500 μl/管PBS重懸細胞，送至重慶醫科大學生命科學院做流式檢測。

1.2.4BMSCs誘導為成骨細胞取生長均勻，密度達80%以上的第三代BMSCs消化為單細胞懸液，計數后按照每孔3×104/cm2接種于24孔板中。觀察細胞密度達70%~80%時換為SD大鼠BMSCs成骨誘導分化培養基培養。每3 d全量換液。培養14~21 d后茜素紅染色鑒定是否誘導成功。同時相同條件下接種一塊24孔板，培養期間使用DMEM培養液(含10%胎牛血清)，其余培養條件相同，作為陰性對照。

1.2.5成骨細胞鑒定(茜素紅染色方法)誘導后，將誘導培養液用塑料移液管吸盡，再用1 ml PBS清洗孔板。用2 ml/孔4%多聚甲醛固定30 min。30 min后，將孔板用PBS清洗2次，加入茜素紅染劑1ml/孔，作用3~5 min。最后，將孔板用PBS清洗3遍，倒置相差顯微鏡觀察有無出現被染紅的特異鈣結節。

1.2.6實驗分組處理空白對照組(Control組),成骨細胞培養基中不加任何干預因素；KL組,通過載有KL基因的重組小鼠腺相關病毒rAAV/KL轉染成骨細胞作用72 h；KL+BGJ398組,rAAV/KL轉染成骨細胞24 h后加入BGJ398(3 μmol/L)處理48 h；空載體組(rAAV組),通過rAAV/GFP(對照空病毒載體)轉染成骨細胞，作用72 h；rAAV+BGJ398組,rAAV/GFP轉染成骨細胞24 h后加入BGJ398(3 μmol/L)處理48 h。

1.2.7熒光倒置顯微鏡觀察成骨細胞rAAV/KL表達情況轉染rAAV/KL及rAAV/GFP 72 h后,熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.2.8ELISA檢測各組細胞上清液 KL蛋白表達水平各組細胞分組處理后收集細胞上清液，用 ELISA試劑盒檢測上清液中 KL蛋白的含量，按說明書操作后，用ELISA繪圖軟件CurveExpert1.3 繪制標準曲線，得到回歸方程后根據樣品OD值查找樣品濃度。

1.2.9RT-PCR檢測成骨細胞KL及骨鈣素(OCN)、骨橋蛋白(OPN)mRNA 的表達按照RNAiso Plus試劑說明書提取細胞總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計下檢測RNA 260/280 比值為1.9，10 μl體系反轉錄合成cDNA，然后25 μl體系擴增，按照：94℃、4 min→94℃、30 s→60℃、30 s→72℃、45 s→循環至94℃、30 s→72℃、1 min→4℃、4 min。PCR引物序列見表1。反應結束后，電泳、成像，用Quantity One圖像分析軟件分析圖像灰度值。

表1　PCR引物序列及產物大小

2結果

2.1BMSCs細胞生長情況原代培養24 h后可見大量造血細胞漂浮,有少量肌肉碎片，培養液渾濁略發黃。72 h首次換液，可見少量貼壁細胞，呈短梭形或多角形；培養第6天可見細胞開始呈集落打旋生長，密度可達50%；培養至第13天,觀察到細胞密度可達85%以上，以長梭形為主，用0.25%胰酶消化后以1∶2比例傳代。見圖1。

2.2流式鑒定BMSCs結果流式細胞儀分析結果顯示BMSCs表達CD90、CD44、CD45分別為98.41%，91.70%，1.27%。

2.3茜素紅染色結果誘導培養3 d后細胞體積增大，主要呈短梭形；6 d時見細胞開始變為多角形，胞質內細胞顆粒增多；11d觀察見胞質內充滿顆粒，開始出現金屬光澤的鈣質沉積；13 d左右見結節中心的細胞逐漸融合失去正常細胞結構；誘導14~21 d后茜素紅染色可見紅色鈣鹽沉積，而對照組無。見圖2。

2.4各組大鼠成骨細胞表達KL情況轉染了rAAV/KL及rAAV/GFP的細胞熒光強度明顯高于其他各組，且表達熒光細胞多，表明rAAV在成骨細胞中可以表達，見圖3。RT-PCR檢測結果表明：轉染rAAV/KL組細胞顯著表達KL mRNA，其他組未見表達，見圖4。ELISA 結果顯示，轉染了rAAV/KL上清液中的分泌性 KL蛋白表達〔(76.33±0.59)pg/ml〕明顯高于其他組〔Control、rAAV、rAAV+BGJ398組分別為(4.94±0.48)、(4.77±0.39)、(4.94±0.10)pg/ml(P<0.01)；KL+BGJ398組K蛋白含量為〔(75.84±0.28)pg/ml〕。表明KL已成功轉染至成骨細胞。

圖1　BMSCs細胞生長情況(×100)

圖2　成骨細胞茜素紅染色結果(×100)

圖3　熒光倒置顯微鏡觀察成骨細胞熒光表達情況(×100)

A: Control組，B: KL組，C: KL+BGJ398組，D: rAAV組，E: rAAV+BGJ398組；M：marker，下圖同 圖4　RT-PCR檢測成骨細胞KL mRNA的表達

2.5各組細胞骨橋蛋白(OPN)mRNA表達RT-PCR結果顯示，rAAV/KL單獨處理72 h后，OPN表達量(0.320)明顯低于Control組(0.825)(P<0.05)；轉染KL組較BGJ398(0.812)及KL聯合干預組(0.812)表達OPN的量顯著減少(P<0.05)；BGJ398組與BGJ398 及KL聯合干預組OPN表達量無顯著性差異；KL組較空載體組(0.819)表達OPN量明顯減少(P<0.05)；空載體組與空載病毒及BGJ398聯合干預組表達OPN量無顯著性差異。見圖5。

2.6各組細胞OCN mRNA表達rAAV/KL單獨處理72 h后，OCN表達量(0.638)明顯高于Control組(0.339)(P<0.05)；轉染KL組較BGJ398(0.339)及KL聯合干預組(0.323)表達OCN的量顯著增加(P<0.05)；BGJ398組與BGJ398 及KL聯合干預組OCN表達量無顯著性差異；KL組較空載體組(0.294)表達OCN量明顯增加(P<0.05)；空載體組與空載病毒及BGJ398聯合干預組表達OCN量無顯著差異。見圖6。

圖5　RT-PCR檢測成骨細胞OPN mRNA的表達

圖6　RT-PCR檢測成骨細胞OCN mRNA的表達

3討論

如前所述，轉型升級、知識服務與融合發展之間的關系在于：轉型升級是個過程，是個有起點無終點的過程，新聞出版業將處于并將長期處于轉型升級的過程中；融合發展是一種狀態，是傳統媒體與新興媒體、傳統出版與新興出版、傳統業態與新興技術相互交融、通融、互融、共融的狀態；知識服務是目標，是新聞出版業轉型升級的最終目標，只有當傳統的新聞出版企業由資訊提供商、圖書提供商成功轉型為全方位、立體化、多層次的知識服務提供商時，轉型升級的初衷才會實現，提質增效的目標也才會達成，傳統出版與新興出版、傳統媒體與新興媒體融合發展的狀態也才會出現。

隨著社會人口老齡化，骨質疏松(OP)發生率明顯增高，已成為影響老年人生活質量、導致社會家庭負擔增加的常見疾病之一〔6〕。本實驗提取原代大鼠BMSCs并向成骨方向誘導分化，茜素紅染色結果表明誘導成功，為后續實驗成骨細胞的來源做好了鋪墊。

rAAV具有多種優點，包括安全性好、免疫原性低、能感染分裂細胞和非分裂細胞等，被認為是目前最有應用潛力的基因載體〔7〕。OPN是一種在骨、牙齒等組織高度表達的分泌性糖蛋白〔8〕。OPN在鈣化組織中有以下生物學功能:①調節骨細胞的黏附;②調節破骨細胞的功能;③調節基質礦化功能〔9〕。前期體外研究表明OPN抑制礦化可能是通過抑制羥磷灰石的形成和晶體的形成 ，從而負向調節鈣化〔10〕。本實驗結果間接說明了KL具有促進成骨細胞礦化、成骨的功能。

OCN是骨中最豐富的非膠原蛋白之一〔11〕，其主要功能是維持骨組織正常礦化，通過維持骨正常礦化速率，抑制異常羥磷灰石結晶的形成，促進骨組織礦化物質沉積〔12〕。本實驗結果表明KL蛋白可以促進成骨細胞分泌OCN,促進了成骨細胞的活力與功能。

FGF23屬于FGFs中的一員，因其以激素形式表達功能，又被稱為內分泌FGF。FGF23主要在骨細胞和成骨細胞中表達，其主要功能是抑制腎臟對磷的再吸收和控制維生素D含量，在骨-腎軸中發揮重要的作用〔13〕。Klotho蛋白主要在腎臟遠曲小管和腦脈絡叢表達，有兩種存在形式：跨膜型蛋白和分泌性蛋白〔14〕。研究表明，跨膜型KL作為FGF23的特有的受體輔助因子，通過形成KL-FGF23-FGFR1復合物形式影響FGF23發揮作用〔15〕。Smith等〔14〕通過在體內實驗研究發現經基因轉染方式增加循環中cKL蛋白(來源于模型KL蛋白的胞外區部分,經錨定在細胞膜上的金屬蛋白酶水解脫落而產生的,簡稱cKL)能刺激FGF23的產生而發揮磷代謝調節作用，其機制可能是通過在骨組織cKL-FGF23-FGFR相互作用而實現的。Kuro-o等〔15〕發現缺失KL的小鼠會出現骨量減少的表現：與野生型小鼠相比，其股骨，脛骨，椎骨的皮質骨厚度減少了20%~40%，而這種骨量減少并不同于女性絕經期骨量減少，其表現為同時伴有骨形成和骨吸收的減少，其中骨形成的減少大于骨吸收的減少。本實驗結果表明只有在KL表達增加并且FGF23通路正常的情況下，才會出現成骨細胞活力增加；而當FGF23信號通路被抑制或者KL幾乎不表達時，成骨細胞的活力并無增強。上述研究結果表明KL有可能是通過FGF23-FGFR1信號通路參與調節OP的發生、發展過程。

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〔2014-08-25修回〕

(編輯徐杰)