激活素A高表達對ActA/Smads通路基礎活化水平的影響

激活素A高表達對ActA/Smads通路基礎活化水平的影響

王姣琦徐仲航1王一鳴1何金婷邵延坤紀秋野2劉永峰3莽靖徐忠信

(吉林大學中日聯誼醫院神經內科，吉林長春130033)

摘要〔〕目的探討激活素(Act)A細胞內高表達對ActA/Smads通路基礎活化水平的影響。方法以ActβA重組載體(ActA-pIRES2-EGFP)和空載體(pIRES2-EGFP)穩定轉染的PC12細胞為陽性和陰性轉染組，正常PC12細胞為對照，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Western印跡法檢測3組細胞內ActA、Smad3和磷酸化Smad3在轉錄及蛋白水平的表達，激光共聚焦觀察Smad4的質核分布情況。結果與陰性轉染組相比，陽性轉染組ActA mRNA及蛋白表達分別提高4.5和1倍，Smad3總蛋白及磷酸化蛋白表達分別提高了36.4%和86.9%，Smad4蛋白在陽性轉染組細胞核內分布增加。結論ActA內源性高表達可提高PC12細胞內ActA/Smads通路的基礎活化水平。

關鍵詞〔〕ActA；ActA/Smads；Smad3；Smad4

中圖分類號〔〕R331.36；R743〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金面上資助項目(81371298)；吉林省科發展計劃國際合作項目(20120723)；吉林省產業技術研究與開發項目(2013C030-4)；吉林大學大學生國家級創新基金項目(2014A79339)

通訊作者：莽靖(1978-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事腦缺血研究。

1吉林大學白求恩醫學部臨床醫學院

2吉林大學中日聯誼醫院科學研究中心

3美國奧爾巴尼醫學院心血管研究中心

徐忠信(1965-)，男，教授，博士生導師，主要從事腦缺血損傷與保護研究。

第一作者：王姣琦(1987-)，女，在讀博士，主要從事腦缺血研究。

Effect of increased Activin A expression to the basic activation of ActA/Smads signaling

WANG Jiao-Qi，XU Zhong-Hang，WANG Yi-Ming，etal.

Department of Neurology，China-Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun 130033，Jilin，China

Abstract【】ObjectiveTo explore the effect of increased intracellular Activin (Act)A expression on the basic activation of ActA/Smads signaling in PC12 cells.MethodsRecombinant ActβA vector (ActA-pIRES2-EGFP) and black vector (pIRES2-EGFP) stably transfected rattus PC12 pheochromocytoma cells were used as positive and negative groups，with normal PC12 cells as control.The expressions of ActA，Smad3 and phosphorylated Smad3 were detected by real time RT-PCR and Western blot.And the distribution of Smad4 in cells was observed under the confocal laser scanning microscope at 554 nm.ResultsThe expression of ActA mRNA in positive group was dramatically increased by 4.5 times compared to that in negative group，while its protein was doubled，suggesting the increased ActA expression due to recombinant vector transfection.Then the expressions of Smad3 total protein and phosphorylated protein in positive group were respectively increased by 36.4% and 86.9% compared to negative group.Moreover the intranuclear mobility of Smad4 was also ascended in positive group.ConclusionsIncreased intracellular expression of ActA could promote the basic activation of ActA/Smads signaling in PC12 cells.

【Key words】ActA；ActA/Smads；Smad3；Smad4

研究發現，轉化生長因子(TGF)-β超家族的成員之一的激活素(Act)A在中樞神經系統表達〔1，2〕。缺血性腦卒中發生后，損傷區神經細胞內ActA表達增加，ActA/Smads信號轉導通路激活〔3，4〕，其ActA/Smads信號轉導通路活化在缺血性腦卒中的神經保護功能已得到證實〔5~7〕。但ActA內源性高表達對ActA/Smads通路基礎活性的影響尚不清楚。本研究利用ActA重組真核表達載體穩定轉染的PC12細胞，通過檢測ActA、Smad3及磷酸化Smad3表達和Smad4質核分布情況，為尋找提高ActA/Smads通路神經保護功能的有效方法提供依據。

1材料與方法

1.1主要材料大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞，穩定轉染大鼠ActβA重組真核表達載體的PC12細胞均由本課題組提供。G418購自美國Gibco公司，Trizol 總RNA提取試劑盒購自生工生物工程技術服務有限公司。小鼠抗大鼠ActA抗體，兔抗大鼠Smad4抗體購自美國Abcam公司，Quantscript cDNA第一鏈合成試劑盒、Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒購自天根生化科技有限公司。小鼠抗大鼠β-actin抗體購自美國Santa公司，兔抗大鼠Smad3及磷酸化Smad3抗體購自美圖ThermoFisher公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔，羊抗鼠二抗購自北京博士德生物技術有限公司，Cy3標記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物技術有限公司。ActA、Smad3及內參GAPDH基因引物委托上海生工合成。

1.2細胞培養及分組PC12細胞常規培養在含10%馬血清，10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中。穩定轉染大鼠ActβA重組載體(ActA-pIRES2-EGFP)及空載體(pIRES2-EGFP)的PC12細胞為陽性組和陰性轉染組，正常PC12細胞為對照。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測ActA、Smad3基因mRNA的表達收集細胞，提取總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明書步驟進行反轉錄操作，制備cDNA。參照Real Master Mix(SYBR Green)說明書檢測，ActA及內參基因引物為，ActA上游引物：5′-GGCAAGGTCAACATCTGCTGTA-3′，下游引物：5′-ACTCCTCCACGATCATGTTCTG-3′，片段大小246 bp；GAPDH上游引物：5′-GGTTACCAGGGCTGCCTTCT-3′，下游引物：5′-ATGGGTTTCCCGTTGATGAC-3′，片段大小171 bp。結果應用Relative Quantification (ddCt) Study進行相對表達量(RQ)分析，計算各基因在各組細胞之間的相對表達水平〔8〕。實驗重復3次。

1.4Western印跡檢測蛋白表達RIPA裂解液提取陽性轉染組、陰性轉染組及對照組細胞總蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白濃度。各組蛋白經金屬浴加熱煮沸后上樣，SDS-PAGE電泳后轉膜、封閉，隨即一抗孵育過夜。使用的一抗分別為小鼠抗大鼠ActA(1∶500)，兔抗大鼠Smad3(1∶500)，磷酸化Smad3(p-Smad3)(1∶500)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶1 000)。次日洗膜后使用辣根過氧化物酶耦聯的羊抗鼠或羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫孵育，繼而增強型化學發光法(ECL)顯影壓膠片。利用凝膠圖像分析系統掃描膠片，ImageJ灰度分析，以目的條帶與其對應內參條帶的灰度比值來表示目的蛋白的相對表達水平。

1.5激光共聚焦觀察Smad4質核分布情況將3組細胞以2.5×104/孔~5×104/孔接種于預先放有細胞爬片的24孔板內，次日細胞貼壁后取出爬片，經0.3% Triton X-100通透，牛血清白蛋白(BSA)封閉后加入Smad4一抗(1∶500)4℃濕盒中孵育過夜。而后于避光條件下加入Cy3標記的羊抗兔IgG抗體37℃作用60 min，繼而再用4，6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)(1 μg/ml)37℃避光孵育15 min，防淬滅封片劑封片后，共聚焦顯微鏡在554 nm觀察Smad4在各組細胞內的質核分布情況。

1.6統計學處理應用SPSS10.0統計軟件包進行獨立樣本t檢驗、多個樣本單因素方差分析及組間Studentst檢驗。

2結果

2.1各組Smad3表達比較ActA細胞內高表達可上調Smad3表達(圖1)。其灰度分析示，與陰性轉染組(4.20±0.31)相比，陽性轉染組Smad3總蛋白表達(5.73±0.27)升高了36.4%，差異顯著(P<0.05)。此外，Smad3磷酸化蛋白表達在陽性轉染組(4.13±0.16)也較陰性轉染組(2.21±0.15)提高了86.9%，差異顯著(P<0.05)。

圖1　ActA、Smad3及磷酸化Smad3 蛋白表達檢測

2.2各組ActA表達比較與陰性轉染組(2.07±0.82)相比，陽性轉染組ActA mRNA表達(11.43±1.88)提高了4.5倍(P<0.05)。見圖1。其灰度分析示，陽性轉染組(10.42±1.9)較陰性轉染組(5.02±1.4)提高了1倍(P<0.05)。而ActA mRNA及蛋白在陰性轉染組(2.07±0.82；5.02±1.4)及對照組(1.98±1.09；4.76±1.6)的表達水平無顯著差異(P>0.05)。說明ActA重組真核載體穩定轉染可顯著提高PC12細胞內ActA表達。

2.3Smad4質核分布比較Cy3標記的Smad4在激光共聚焦顯微鏡554 nm的激發光下呈紅色熒光，細胞核經DAPI染色后呈藍色。陽性轉染組Smad4在細胞核內分布明顯高于陰性轉染組及對照組(圖2)。

圖2　激光共聚焦觀察Smad4的質核分布情況(×200)

3討論

缺血性腦卒中損傷機制與干預策略一直是臨床與基礎研究的熱點。體內外研究發現，腦缺血后ActA表達增加，細胞外的ActA通過與細胞膜上的TGF-βⅡ型受體(TβRⅡ)結合磷酸化激活TGF-βⅠ型受體(TβRⅠ)，繼而活化細胞內Smads通路，完成跨膜信號的胞內轉導〔9〕。Smads蛋白根據功能不同一般分為三類，膜受體激活的Smads(R-Smads)，包括Smad1、2、3、5和8，在ActA/Smads通路中主要為Smad2和3發揮作用；通用Smad(Co-Smad)目前僅發現Smad4及抑制性Smads(I-Smads)包括Smad6和7〔10〕。作為ActA/Smads通路的下游位點，磷酸化的Smad2/3與Smads錨著蛋白(SARA)分離并與Smad4形成異二聚體，繼而轉入細胞核，與靶基因的表達調控區結合，完成對靶基因表達的調控〔11〕。

本研究結果說明重組載體穩定轉染提高了PC12細胞內ActA的表達。ActA高表達可提高PC12細胞內ActA/Smads通路的基礎活化水平。將ActA重組載體穩定轉染PC12細胞，提高細胞內ActA的表達可通過上調Smad3表達，促進Smad3蛋白磷酸化活化的方式促進Smad4核內遷移，提高ActA/Smads通路的基礎活化水平。此外，ActA內源性高表達可成為提高ActA/Smads通路神經保護功能的有效方法，其具體的生物學功能還有待進一步研究。

參考文獻4

1Schubert D，Kimura H，LaCorbiere M，etal.Activin is a nerve cell survival molecule〔J〕.Nature，1990;344(6269):868-70.

2Florio P，Gazzolo D，Luisi S，etal.Activin A in brain injury〔J〕.Adv Clin Chem，2007；43:117-30.

3Mukerji SS，Katsman EA，Wilber C，etal.Activin is a neuronal survival factor that is rapidly increased after transient cerebral ischemia and hypoxia in mice〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2007;27(6):1161-72.

4莽靖，何金婷，王嬌琦，等.腦缺血損傷ActA與跨膜受體ActRⅡA在Smads轉導通路中的表達〔J〕.中風與神經疾病雜志，2013;30(1):15-7.

5Mang J，Mei CL，Wang JQ，etal.Endogenous protection derived from Activin A/Smads transduction loop stimulated via ischemic injury in PC12 cells〔J〕.Molecules，2013；18(10):12977-86.

6He JT，Mang J，Mei CL，etal.Neuroprotective effects of exogenous Activin A on oxygen-glucose deprivation in PC12 cells〔J〕.Molecules，2011;17(1):315-27.

7Wang JQ，He JT，Du ZW，etal.Effects of SARA on oxygen-glucose deprivation in PC12 cell line〔J〕.Neurochem Res，2013；38(5):961-71.

8Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method〔J〕.Methods，2001；25(4):402-8.

9Shi Y，Massague J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus〔J〕.Cell，2003;113(6): 685-700.

10Kretzschmar M，Massagué J.SMADs: mediators and regulators of TGF-beta signaling〔J〕.Curr Opin Genet，1998；8(1):103-11.

11Qin BY，Lam SS，Correia JJ，etal.Smad3 allostery links TGF-beta receptor kinase activation to transcriptional control〔J〕.Genes，2002；16(15):1950-63.

〔2014-03-16修回〕

(編輯張慧)