膽酸對大鼠肝部分切除術(shù)后肝細胞脂質(zhì)代謝及法尼醇X受體表達的影響

膽酸對大鼠肝部分切除術(shù)后肝細胞脂質(zhì)代謝及法尼醇X受體表達的影響

丁隆楊宇1曲義坤何淑玲孫國娟夏偉濱徐劍

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探討膽酸對肝細胞脂質(zhì)代謝、法尼醇X受體(FXR)及肝再生的影響。方法建立部分肝切除大鼠模型，隨機分成3組：G1組(正常喂養(yǎng))，G2組(給予0.2%膽酸喂養(yǎng))，G3組(正常飲食中加入50%葡萄糖)，每組10只，喂養(yǎng)后7 d切除大鼠70%肝組織，于術(shù)后72 h取出肝組織及血液標本，檢測相關指標。RT-PCR和Western印跡檢測SHP、CYP7A1、BSEP的表達；試劑盒檢測肝細胞中甘油三酯、膽固醇的水平。結(jié)果與G1相比，G2組小異二聚體伴侶(SHP)、膽鹽輸出泵(BSEP)表達顯著升高(P<0.05)，膽固醇7α-羥化醇(CYP7A1)表達顯著降低(P<0.05)；G3組SHP、BSEP表達略增高(P<0.05)，CYP7A1顯著升高(P<0.05)。G2組甘油三酯(TG)水平顯著降低，膽固醇(TC)含量顯著升高，而G3組TG略升高，TC含量降低(均P<0.05)。結(jié)論膽酸可促進肝細胞再生，F(xiàn)XR在調(diào)控肝細胞代謝中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞〔〕法尼醇X受體(FXR)；脂質(zhì)代謝；肝再生

中圖分類號〔〕R-34〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(81141047)；佳木斯大學科學技術(shù)重點項目(Sjz2012-12)

通訊作者：楊宇(1975-)，男，醫(yī)學碩士，副教授，主要從事人體解剖學及肝再生研究。

1佳木斯大學基礎醫(yī)學院局部解剖學教研室

第一作者：丁隆(1978-)，女，醫(yī)學博士，副主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事肝移植免疫、肝再生研究。

Effects of bile acid on the expression of FXR and lipid metabolism on rat model of hepatectomy

DING Long, YANG Yu, QU Yi-Kun,etal.

First Hospital Affiliated to Jiamusi University, Jiamusi 154002, Heilongjiang, China

Abstract【】ObjectiveObjectives To investigate the effect of bile acid on lipid metabolism and FXR expression in rat model of hepatectomy.MethodsRats were divided into group1 (fed with normal diet), group2 (normal diet plus 0.2% bile acid) and group3 (normal diet plus 50% glucose). There were 10 rats in each group. At day 7, rats were subjected to 70% hepatectomy. At 72 h postoperation, the mRNA and protein levels of SHP, CYP7A1, BSEP were detected by RT-PCR and Western blot, triglyceride (TG) and cholesterol (TC) levels in the liver cells were detected by kit.ResultsExpressions of SHP, BSEP were increased while CYP7A1 decreased significantly (P<0.05) in the group2 contrary to group3 (P<0.05) comparing to group1. TG level was decreased in group2 and increased in group3, on the contrary, level of TC was increased in group2 and decreased in group3, the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionsBile acid could promote regeneration of liver cell, FXR plays an important role in the regulation of hepatocyte metabolism.

【Key words】FXR; Lipid metabolism; Liver regeneration

肝再生是肝臟組織損傷后修復的過程，研究表明肝臟的再生不需有干細胞的參與，而是由分化成熟的和大量休眠的肝細胞增殖完成，其具體機制雖尚不清晰，但已表明是由細胞活化、脂質(zhì)代謝和細胞分裂共同構(gòu)成的細胞反應〔1〕，在手術(shù)、創(chuàng)傷、中毒、感染、壞死及肝移植等所致的肝損傷恢復過程中發(fā)揮著重要的作用。膽汁酸由膽固醇合成，后者也是其重要成分。研究表明膽汁酸參與了肝再生過程。法尼醇X受體(FXR)為主要表達于肝臟、腸道、腎臟和腎上腺的一種代謝性核受體，能夠通過多種途徑調(diào)節(jié)膽汁酸和膽固醇的代謝，F(xiàn)XR還能夠調(diào)控肝再生過程中的能量代謝平衡而影響肝再生〔2，3〕。本研究將對膽汁酸在肝再生過程中的脂質(zhì)代謝及其與FXR表達的關系進行探討，以期為肝損傷修復的研究提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑大鼠購于佳木斯大學實驗動物中心；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自Hyclone；總RNA提取試劑盒、TIAN Script RT Kit、2×Taq PCR Master Mix購自天根生化科技有限公司；小異二聚體伴侶(SHP)、膽固醇7α-羥化醇(CYP7A1)抗體購自Santa cruz；膽鹽輸出泵(BSEP)抗體購自abcam；甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；引物委托生工生物(上海)有限公司合成；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗動物及實驗分組建立部分肝切除大鼠模型，術(shù)前大鼠禁食12 h，不禁水，隨機分成G1組(正常喂養(yǎng))，G2組(給予0.2%膽酸喂養(yǎng))，G3組(正常飲食中加入50%葡萄糖)，每組10只，喂養(yǎng)后7 d切除大鼠70%肝組織，分別于術(shù)后72 h取出肝組織及血液標本，檢測相關指標。

1.3增殖細胞核抗原(PCNA)測定新鮮肝臟樣本立即在中性甲醛溶液固定。石蠟切片，內(nèi)源性過氧化物酶和3%過氧化氫(上海化學試劑國藥控股，中國)阻斷、封閉。添加鼠單克隆抗體對PCNA(sc-252820；1∶50；美國Santa cruz)孵化，4℃過夜。添加HRP-鼠標抗體(1∶200；A0216中國Beyotime生物技術(shù)研究所)孵化30 min 37℃。二氨基聯(lián)苯胺染色2 min后滴加蘇木素復染1 min，分化、封片。

1.4RT-PCRTRIzol法提取細胞總RNA，并按照TIAN Script RT Kit試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別設計并合成SHP、CYP7A1、BSEP、β-actin引物序列如表1。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳凝膠成像后以β-actin為內(nèi)參進行灰度分析。

表1　引物信息

1.5Western印跡肝細胞提取后加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白并調(diào)平。取總蛋白40 μg，加入上樣緩沖液煮沸5 min，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋一抗(SHP 1∶100，CYP7A1 1∶100，BSEP 1∶1 000，Caveolin-1 1∶2 000)4℃孵育過夜，PBS洗膜3次，加入稀釋二抗37℃孵育15 min。電化學發(fā)光(ECL)法進行底物發(fā)光，于暗室中曝光成像。

1.6TG和TC含量的測定提取肝細胞后加入0.25%胰酶消化并計數(shù)，反復凍融法裂解細胞，加入異丙醇萃取TG和TC，10 000 r/min離心5 min，取上清。按照試劑盒說明書分別檢測。

1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1膽酸對肝再生的影響與G1組比較，G2組肝細胞增殖顯著增高(P<0.05)，G3組則有所下降(P<0.05)。見圖1。

圖1　各組PCNA的表達變化(×40)

2.2膽酸對脂質(zhì)代謝相關蛋白的影響與G1組相比，G2組SHP和BSEP mRNA和蛋白表達顯著升高(P<0.01，P<0.01)，CYP7A1 mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.01)，G3組SHP和BSEP mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.01，P<0.05)，CYP7A1 mRNA和蛋白顯著升高(P<0.01)。G2和G3組上述指標亦差異顯著(P<0.05)。見圖2。

與G1組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與G2組比較：3)P<0.05 圖2　各組SHP、CYP7A1、BSEP mRNA和蛋白的表達

2.3膽酸對TG、TC含量的影響與G1組相比，G2組TC含量顯著降低(P<0.05)，TG顯著升高(P<0.01)，G3組TC含量顯著升高(P<0.05)，而TG顯著降低(P<0.01)。G2和G3組上述指標差異顯著(P<0.05)。見表2。

表2　各組細胞內(nèi)TG和TC的含量比較

與G1組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與G2組比較：3)P<0.05

3討論

肝臟的再生不需有干細胞的參與，而是由分化成熟的和大量休眠的肝細胞增殖完成，實現(xiàn)自我再生是臨床肝受損后恢復的重要生理過程，所以提高肝的再生能力對于肝損傷的修復具有重要作用。肝再生過程啟動了一連串的因子及基因活化，同時激發(fā)各種物質(zhì)代謝及細胞活化機制：如脂類代謝、細胞分裂等。肝臟再生必須依賴于能量代謝的正常進行，其中膽汁酸為膽固醇經(jīng)肝臟代謝的終產(chǎn)物，能夠反映肝細胞的合成以及代謝狀態(tài)。體外研究表明，生理濃度的膽汁酸能夠促進肝細胞增殖〔4，5〕，然而超負荷的膽汁酸能夠引起肝細胞變性壞死〔6~8〕，既往研究表明，F(xiàn)XR基因敲除小鼠行70%肝切除后，肝再生明顯受到抑制，F(xiàn)XR對膽汁酸代謝的調(diào)控在肝再生過程中發(fā)揮著重要的作用〔9，10〕。

FXR被激活后，能夠促進SHP表達〔11〕，SHP進一步與肝臟相關同系物(LRH)結(jié)合，抑制CYP7A1轉(zhuǎn)錄〔12〕，CYP7A1是膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸主要途徑的限速酶〔13〕，CYP7A1表達的抑制降低了膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，減輕了剩余肝臟的膽汁酸負荷，促進了肝再生。BSEP也為FXR的靶基因，具有調(diào)控肝細胞內(nèi)膽汁酸濃度的作用。本研究提示脂類代謝參與了肝再生過程。適度的膽酸促進了TG、TC的代謝，減少了肝組織內(nèi)脂類堆積，減輕了肝臟毒性，而葡萄糖過載卻加重了脂類對肝細胞毒性，損傷了肝再生。證明葡萄糖過載并不能促進肝細胞再生反而會抑制肝再生〔14〕。

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12Anakk S，Watanabe M，Ochsner SA，etal.Combined deletion of Fxr and Shp in mice induces Cyp17a1 and results in juvenile onset cholestasis〔J〕.J Clin Invest，2011；121：86-95.

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〔2014-01-17修回〕

(編輯苑云杰)