山茱萸多糖對衰老模型小鼠肝組織SIRT1和p53基因表達的影響

山茱萸多糖對衰老模型小鼠肝組織SIRT1和p53基因表達的影響

李晶歐芹江旭東王迪迪樸金花

(佳木斯大學基礎醫學院生物化學教研室，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的研究山茱萸多糖對衰老模型小鼠肝細胞SIRT1和p53基因表達的影響。方法采用半定量RT-PCR法測定小鼠肝組織SIRT1 mRNA和p53 mRNA的表達，并觀察山茱萸多糖對其影響。結果與青年對照組相比，衰老模型組小鼠p53 mRNA表達增高，SIRT1 mRNA表達降低(P<0.01)。山茱萸多糖可降低p53基因表達(P<0.05)，使SIRT1基因表達增強，但與衰老模型組相比差異無統計學意義(P>0.05)；山茱萸多糖大小劑量組間無明顯差異(P>0.05)。結論山茱萸多糖通過影響SIRT1對p53的作用而延緩衰老。

關鍵詞〔〕山茱萸多糖；衰老；p53；SIRT1

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：黑龍江省衛生廳課題(2010-483)

通訊作者：樸金花(1974-)，女，副教授，碩士，主要從事衰老與抗衰老分子機制的研究。

第一作者：李晶(1975-)，女，碩士，副教授，主要從事衰老與抗衰老分子機制的研究。

衰老是一個復雜、多因素共同調控的生理過程，其發生機制是否受基因調控目前還不十分清楚。有研究顯示，當熱量限制后，真菌、線蟲、果蠅甚至大鼠等動物的壽命可明顯延長，這種作用和組蛋白去乙酰化酶-sirtuin蛋白家族有關〔1〕。沉默信息調節因子1(SIRT1)是哺乳動物該家族成員中研究最多的一種，是調節生物體衰老進程的一個重要基因，其基本活性是依賴NAD+的去乙酰化酶，在調節基因表達、細胞凋亡、代謝和老化過程中發揮重要作用〔2〕。在氧化應激條件下，SIRT1可通過對FOXO3和p53等的調節，促進細胞在氧化應激條件下的存活，提示可能有延長細胞壽命的作用〔3〕。Sirtuin家族由于具有調控多種生理過程的功能，使其成為備受關注的治療代謝和衰老相關疾病的潛在靶點。山茱萸多糖可通過提高機體抗氧化能力、抑制脂質過氧化、提高老化相關酶活性發揮抗衰老作用。本實驗分析山茱萸多糖對衰老小鼠肝組織SIRT1和p53基因表達的影響，探討山茱萸多糖抗衰老作用的機制是否與SIRT1的表達有關。

1材料與方法

1.1藥品及實驗動物選用Wistar 小鼠由佳木斯大學實驗動物中心提供(許可證號：SYXK黑20030014)。山茱萸多糖購自寶雞市方晟生物開發有限公司，經佳木斯大學藥學院鑒定。

1.2動物分組及處理將Wistar小鼠100只，雌雄各半，2~3月齡，體重18~22 g，隨機分為青年對照組、衰老模型組、山茱萸多糖小劑量組和大劑量組，每組25只(每組小鼠列數在實驗過程中有死亡、取材損耗，為保證最終每組個數10只)。各組正常飲食，衰老模型組每日上午頸背注射D-半乳糖(D-gal)(48 mg/kg)，連續45 d，造模成功后經胃給予相當于給藥組藥量體積的溫開水連續30 d；大小劑量給藥組除按模型組注射D-gal外，每日分別按0.4和0.2 g/kg體重灌服山茱萸多糖。連續30 d后于末次給藥后次日處死小鼠提取肝組織，液氮保存備用。

1.3指標的測定采用Trizol法提取肝組織RNA，核酸蛋白分析儀測定濃度及純度。采用電泳凝膠成像系統觀察RT-PCR法檢測p53、SIRT1 mRNA表達水平：cDNA反應體系：引物選擇Oligo dT18-Adaptor Primer，5×RNA PCR緩沖液5 μl，無RNA酶水6.5 μl，dNTP混合物4 μl，RNA酶抑制劑0.5 μl，AMV逆轉錄酶1 μl，Oligo-dT 引物1 μl，RNA樣品2 μl，混勻，移入PCR儀，42℃ 60 min;95℃ 5 min;1次循環。PCR反應：采用β-actin和GAPDH作內參，GAPDH引物5＇CTGAATTCGGGCTCTCCAGAACATCATC-3＇，5＇-CAGGATCCCCAGCGTCAAAGGTGGA-3＇(擴增產物302 bp)；β-actin引物 5＇-CTACAATGAGCTG CGCGTGGC-3'，5＇-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3＇(擴增產物242 bp)；p53引物5＇-AAGACAGGCAGACTTTTCGCCACAG-3＇，5＇-AGGCACAAACACGAACCTCAAAG-3＇(擴增產物248 bp)；SIRT1引物5'-GAACCTTTGCCTCATCTACATTTTG-3'，3'-CAAGTA AATAGTCTCAACGGTGGTT-5'(擴增產物393 bp)。94℃ 5 min,1循環，94℃ 40 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s；35個循環，72℃ 7 min。PCR產物以凝膠成像系統掃描，以各組中cDNA擴增產物的條帶與內參β-actin和GAPDH條帶灰度值比值(p53/GAPDH和SIRT1/β-actin)表示mRNA水平。

1.4統計學處理采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

M：Marker 1~4：青年對照組、衰老模型組、山茱萸小劑量組、山茱萸大劑量組，下圖同 圖1　各組小鼠肝組織p53 mRNA的表達

2結果

與青年對照組相比，衰老模型組SIRT1 mRNA表達下降，p53 mRNA表達顯著增高(P<0.01)；與衰老模型組比較，大、小劑量給藥組SIRT1 mRNA升高，但差異不顯著(P>0.05)；與衰老模型組相比p53 mRNA表達降低(P<0.05)，但兩給藥組間相比較表達無差別(P>0.05)。見表1，圖1，圖2。

表1　山茱萸多糖對衰老模型小鼠肝組織 SIRT1和p53

與青年對照組比較：1)P<0.01,與衰老模型組比較：2)P<0.05

圖2　各組小鼠肝組織SIRT1 mRNA的表達

3討論

SIRT1是一種依賴NAD+的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，在維持基因組的穩定性、細胞分化、衰老、凋亡、DNA損傷修復、有絲分裂調控、抗凋亡等生命活動及能量、內分泌代謝調節中起重要作用，同時在基因沉默、表觀遺傳學修飾、轉錄調控及信號轉導調節中發揮重要的生物學功能〔4~6〕。SIRT1在一定程度上延長壽命的原因是它升高或降低了轉錄相關基因的活性，它可以抑制p53引起的細胞凋〔7〕。p53基因是一種與細胞凋亡、癌變、衰老和基因修復相關的重要基因，主要功能是在細胞受到破壞和基因組受到損傷時起到細胞周期的剎車作用。本實驗結果說明在細胞處于氧化壓力和DNA損傷時p53表達增強，使得p53的C端的多個位點被乙酰化，而p53是SIRT1的一種底物，SIRT1可使p53基因去乙酰化，削弱了p53基因的作用效果，使p53成為無活性形式，進而減少凋亡的可能性并延長細胞壽命。但山茱萸多糖用藥組SIRT1 mRNA表達與衰老模型組比較，沒有明顯差異，可能由于實驗條件的限制，未能觀察更多數量的動物，樣本小不足以觀察到顯著性差異，有待進一步擴大樣本量證實。山茱萸多糖用藥組大小兩劑量間無明顯差異。綜上，山茱萸多糖可以通過調控SIRT1對p53基因的表達而發揮抗衰老作用。

參考文獻4

1羅蘭，高政南，程麗靜，等.SIRT1與基因轉錄〔J〕.中國生物化學與分子生物學報，2007；23(3):187-93.

2吳夢然，張紅勝，周洪森.SIRT1與衰老的關系〔J〕.生命的化學，2009；29(2):197-201.

3蔡群芳，周鵬.去乙酰化酶sirtuin研究進展〔J〕.生命科學，2006；18(2)：133-7.

4Easton J，Wei T，Lahti JM，etal.Disruption of the cyclinD/cycIin-dependent kinase/INK4l retinoblastoma protein regulatory pathway in human neuroblastoma〔J〕.Cancer Res，1998；58(12)：2624-32.

5Fong LY，Nguyen VT，Farber JL，etal.Early deregulation of the pl6 ink4a-cyclinDl/cyclin-dependent kinase 4-retinoblastoma pathway in cell proliferation-driven esophageal tumorigenesis in zinc-deficient rats〔J〕.Cancer Res，2000;60 (16):4589-95.

6Serrano M，Beach D,Hannon GJ，etal.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4〔J〕.Nature，1993；366：704-7.

7郭亦琦，施冬云，王君暉.sirt基因家族及其對細胞壽命的調節〔J〕.生物物理學報，2006；26(1)：7-11.

〔2013-09-28修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)