SD大鼠肺成纖維細胞的原代培養及分離純化

SD大鼠肺成纖維細胞的原代培養及分離純化

何愛明1李曉暉1李岱2

(福建師范大學福清校區生化系，福建福清350300)

摘要〔〕目的建立大鼠肺成纖維細胞的體外高效穩定的培養方法。方法取成年SD大鼠，采用差速貼壁法純化與胰酶反復消化法傳代，得到純度更高產量更多的肺成纖維細胞。所得細胞采用免疫細胞化學方法加以鑒定，且進行生長曲線測定。結果肺成纖維細胞純化率可達99.3%，細胞增殖快,生長良好，產量大。結論成功建立了肺成纖維細胞純化與傳代的方法,適用于細胞水平上的間質性肺病發病機制的研究。

關鍵詞〔〕肺成纖維細胞;原代培養;純化

中圖分類號〔〕R33〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家青年科學

通訊作者：李岱(1982-)，男，博士后，助理研究員，主要從事分子藥理學研究。

1中南大學藥學院藥理系2中南大學湘雅醫院藥劑科

第一作者：何愛明(1967-)，女，碩士，副教授，主要從事呼吸藥理學研究。

Primary culture and isolation and purification of SD rat lung fibroblasts

HE Ai-Ming,LI Xiao-Hui,LI Dai.

Department of Biochemistry, Fuqing Campus, Fujian Normal University, Fuqing 350300, Fujian, China

Abstract【】ObjectiveTo establish an efficient and stable culture method of rat lung fibroblasts in vitro.MethodsThe more purified and more production lung fibroblasts were obtained from adult Sprague Dawley rats isolated by improved velocity sedimentation adherence method and repeated digestion method.The cells were identified by immunochemical stain to determine the growth curve.ResultsThe purification rate of lung fibroblasts was 99.3% and they showed strong proliferative ability, grew well and more production.ConclusionsThe purification and subculture technique for lung fibroblast is developed successfully, which is useful to explore the pathologic mechanisms of interstitial lung disease in cellular level.

【Key words】Lung fibroblast;Primary culture;Purification

肺成纖維細胞不僅是重要的間質細胞，也是活躍的分泌細胞，并表現出免疫炎癥細胞的特征。它可合成膠原蛋白、彈性蛋白等組織基質成分，合成基質金屬蛋白酶和組織型金屬蛋白酶抑制物，通過調節細胞外基質代謝，參與組織重建。體外成功培養肺成纖維細胞是研究肺部疾病如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化等的重要手段和工具。如何建立一種較簡單易行、經濟實惠、高單細胞收率、高純度、高存活率的培養方法,仍是肺成纖維細胞培養模型制作中的關鍵問題。本實驗借鑒前人的經驗基礎上,采用改良的方法培養出純度較高、活力較強的SD大鼠肺成纖維細胞。

1材料與方法

1.1材料、動物及試劑與儀器雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級，體重250 g，中南大學實驗動物學部提供。DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司)、胎牛血清(天津灝陽生物技術有限公司)、胰蛋白酶(美國Invitogen公司)、小鼠抗大鼠Vimentin 單克隆抗體(美國Abcam公司)、山羊抗鼠HRP 標記二抗(美國Santa Cruz公司)、DAB顯示劑(美國Vector公司)。CO2細胞培養箱(FORMA3111，美國Thermo公司)、高性能超凈工作臺(上海瑞仰凈化裝備有限公司)、倒置相差顯微鏡(1×70型，日本Nikon公司)、移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1肺成纖維細胞原代培養取250 g SPF級雄性SD大鼠1只，10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，分離頸總動脈，剪斷放血。大鼠移入超凈臺，開胸取肺，去除肺組織表面胸膜，剪切距離肺周邊1 mm 內的肺組織，并將其放入玻璃培養皿。用滅菌的PBS液反復沖洗，去除血液及漂浮的結締組織，直至PBS 液變為澄清。用手術剪將周邊肺組織反復剪切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，用含10%胎牛血清的DMEM浸潤，然后用眼科彎鑷小心勾取肺組織塊，均勻貼入25 cm2細胞培養瓶一面，組織塊之間距離約為1 cm，將細胞培養瓶放入37℃ 5%CO2濕度為95%的細胞培養箱內培養2 h后，待組織小塊貼附于培養瓶后，取出培養瓶，沿培養瓶無細胞一面小心加入含10%胎牛血清的DMEM 培養液5 ml。培養瓶放回細胞培養箱，小心將培養瓶慢慢平放，使組織小塊完全浸入培養液中，繼續靜置培養96 h，細胞從組織塊周圍完全游出后，用鑷子將組織塊輕輕取下，此后細胞每隔48 h換液1次，細胞生長至接近完全融合成細胞單層時，進行傳代。

1.2.2 肺成纖維細胞傳代培養用0.25%胰蛋白酶消化2 h，觀察到瓶底大部分細胞開始回縮后，傾倒胰蛋白酶，加入培養基中止消化，用玻璃管小心吹下細胞，未吹下的細胞再次用胰酶進行消化，如此反復，使用胰酶的總時間不超過5 min。以1∶2的比例傳代，傳代時利用差時貼壁法，即在傳代時將所得的混合細胞懸液，接種在培養瓶中，靜置于培養箱2 h后，輕輕振搖，傾出尚未貼壁的混雜細胞，進行下一代的培養。每隔2 d換液1次，待細胞鋪滿瓶底后再用同樣的方法進行傳代。實驗選用第3~6代細胞。

1.3 肺成纖維細胞的鑒定

1.3.1 形態學鑒定將培養過程中不同階段的肺成纖維細胞置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.2 波形蛋白免疫細胞化學染色將第3代細胞種在6孔板中進行培養，待細胞融合70%后，按試劑盒說明書進行免疫細胞化學染色。

1.3.3 純度鑒定以胞質出現棕黃色絲狀為陽性信號,計算每孔5個不重疊視野(×100),分別計數每個視野下陽性細胞數所占總細胞數的百分比，計算其平均數。

1.3.4 細胞的生長曲線測定將第3代成纖維細胞消化稀釋,以2×104/ml個細胞接種于12 孔培養板,每孔接種1 ml,于37℃ 5%CO2濕度為95%的細胞培養箱培養,每隔24 h收集3孔細胞并計數,分別取其平均值,每3天換液1次,連續計數7 d后繪制生長曲線。

2結果

2.1 形態觀察組織塊接種入培養瓶后，12 h內即可見組織塊周圍有細胞和組織碎片逸出，并圍繞組織塊形成逸出帶，12 h后逐漸有少量細胞逸出。72 h見有細胞逸出并逐漸伸展呈梭形。第6天左右梭形細胞在局部融合成片，與其他形態細胞形成界限分明的隔離帶，呈接觸抑制現象。此后梭形細胞逐漸在培養瓶內占據優勢，覆蓋培養瓶大部分面積，7 d左右細胞接近完全融合。傳第3代此時細胞呈長梭形、條索狀、多角形、漩渦狀等，見圖1。

2.2 免疫細胞化學鑒定及純度鑒定波形蛋白染色可見視野內細胞幾乎均呈陽性表達(見圖2)。傳到第4代的肺成纖維細胞陽性率達99.3%。

2.3 生長曲線第3代肺成纖維細胞以2×104/ml接種于12孔培養板,細胞于第6天長滿，于第1，2，3，4，5，6，7天細胞數分別為2×104、2.3×104、3×104、4×104、5×105、6×104、6×104個。

培養12 h(×400)

培養72 h(× 400)

培養第6天(×100)

第3代細胞(×100)

圖1肺成纖維細胞形態觀察

圖2　第3代肺成纖維的波形蛋白鑒定(×100)

3討論

肺組織中有支氣管、血管、神經伴行，細胞數量和種類多，包括上皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞、血細胞、神經細胞等多種細胞，經組織塊貼壁法培養，會混雜有多種細胞，但成纖維細胞貼壁速度快，僅僅需40 min左右，首先吸附在瓶壁上〔1〕,本實驗利用差速貼壁法，即在傳代時隔2 h更換培養液，經2~3次貼壁選擇后，貼附幾乎是成纖維細胞，再利用成纖維細胞脫壁也快且對酶性分離敏感的特點，采用0.25%胰蛋白酶分離進行傳代，傳至第4代時純度可達99.3%。

成纖維細胞中間絲的結構蛋白為波形蛋白，不同于上皮細胞的角蛋白,也不同于肌細胞的橋連蛋白,成為不同種類細胞分類鑒定的相對特異性標志〔2〕，本研究免疫細胞化學鑒定結果提示所培養的細胞波形蛋白染色陽性表達，從而證明了該細胞為成纖維細胞。就生長曲線看，在培養1~2 d時就進入指數分裂期，且指數分裂期的持續時間較長達4 d。本實驗使用的方法進行了一些改良，用差速貼壁法與反復消化法，所獲得的肺成纖維細胞具有較強的分裂增殖能力,適應性強,傳代周期短，易培養，性狀穩定，純度高，產量大等特點，可用于細胞水平上研究間質性肺病的發病機制。

參考文獻4

1祝華平,常立文,李文斌，等.胎鼠肺細胞的分離純化及原代培養〔J〕.華中科技大學學報(醫學版),2003;32(6):597-600.

2楊志明.組織工程學〔M〕.北京:化學工業出版社,2002:155-8.

〔2013-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)