山楂葉總黃酮對酒精性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響

山楂葉總黃酮對酒精性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響

李素婷吳淑彥1杜超陳龍

(承德醫學院生化教研室，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究山楂葉總黃酮(FMCL)對酒精性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響并探討其機制。方法昆明種小鼠60只隨機分為正常組、模型組、FMCL低、高劑量組和維生素E陽性對照組。采用白酒灌胃制備急性肝損傷模型，造模同時按劑量(40、80 mg/kg)每天給予FMCL保護，10 d后處死小鼠，TUNEL法檢測肝細胞凋亡情況，HE染色觀察肝組織病理學變化，比色法檢測肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)水平。結果和模型組比較，FMCL明顯降低酒精性肝損傷小鼠肝細胞凋亡指數，TUNEL染色陽性細胞數明顯減少(P<0.01)，肝細胞脂肪變性、炎癥壞死等病理改變明顯好轉；模型組小鼠肝組織MDA含量明顯升高，SOD、GSH活性明顯降低，給予FMCL保護后，MDA含量明顯降低，SOD、GSH活性明顯提高(P<0.05，P<0.01)。結論FMCL對酒精性肝損傷小鼠肝細胞凋亡具有一定的抑制作用，其機制與抑制酒精介導的脂質過氧化有關。

關鍵詞〔〕山楂葉總黃酮；酒精性肝損傷；肝細胞凋亡；脂質過氧化

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省科學技術研究與發展計劃項目(12276104D-93)

1新樂市醫院消化科

第一作者：李素婷(1963-)，女，醫學碩士，教授，碩士生導師，主要從事中藥對肝損傷保護作用及其分子機制的研究。

肝臟是酒精代謝的主要器官，過度飲酒會引起酒精性肝損傷。研究表明，酒精引起的氧化應激介導的肝細胞凋亡在酒精性肝損傷的發生、發展中發揮重要的作用〔1〕。抑制肝細胞凋亡有利于酒精性肝損傷的防治，也是抗酒精性肝纖維化一種治療方法。山楂葉總黃酮(FMCL)是從山楂葉中提取的黃酮類化合物，含有黃酮苷、葒草素、葡荊牡黃酮等多種抗氧化成分，具有很強的清除自由基抗脂質過氧化作用〔2〕，對大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡具有保護作用〔3〕。本研究觀察FMCL對酒精所致小鼠急性肝損傷肝細胞凋亡的保護作用及其機制。

1材料與方法

1.1動物、藥品及儀器昆明種小鼠，雄性，清潔級，體重(22±2)g,石家莊實驗動物管理中心提供。FMCL(純度為80%)：北京中醫藥大學饋贈，臨用前以蒸餾水配置，4℃保存；56°紅星二鍋頭白酒：北京紅星釀酒廠生產； 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)，購于南京建成生物工程研究所；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒，由南京凱基生物科技發展有限公司提供；Olympus顯微鏡和組織切片機：德國Leica公司。

1.2動物造模與藥物處理〔4〕將60只昆明種小鼠隨機分為5組，分別為正常組、模型組、FMCL小劑量(40 mg/kg)組、FMCL大劑量(80 mg/kg)組和維生素E(100 mg/kg)陽性對照組。正常組每天給予蒸餾水0.4 ml灌胃，模型組和給藥組按8 ml/kg灌胃給予56°紅星二鍋頭白酒，2次/d，連續10 d造模結束。自造模第1天起，FMCL組和維生素E組按劑量每天中午灌胃給藥1次，正常組和模型組同時灌服等體積蒸餾水，實驗期間各組小鼠自由飲水、進食。最后一次灌胃結束，禁食不禁水14 h，斷頭處死小鼠。

1.3TUNEL法檢測肝細胞凋亡情況TUNEL法按試劑盒說明書進行操作。凋亡的肝細胞多表現為胞膜完整、核改變，細胞核呈棕黃色染色或細胞質因核DNA逸出而呈陽性染色者為凋亡細胞，肝細胞凋亡小體也呈陽性著色。每例標本選5個高倍視野(400倍)觀察凋亡細胞，計數不少于500個細胞，觀察并計數陽性凋亡細胞核數占該視野肝細胞核總數的比例，取均值以百分數表示，以凋亡指數(AI)反映肝細胞凋亡情況。

1.4肝組織病理學學觀察取小鼠肝左葉,置10%中性甲醛溶液中固定,常規石蠟包埋、切片機切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織脂肪變性和炎癥、壞死等病理改變。

1.5肝組織MDA、SOD、GSH水平的檢測取小鼠肝左葉，以生理鹽水制備成10%的肝勻漿，比色法檢測肝勻漿MDA含量和SOD、GSH活性。

1.6統計學處理采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1FMCL對酒精引起小鼠肝細胞凋亡的保護作用正常組小鼠肝組織無或偶見肝細胞凋亡〔(2.92±0.88)%〕；模型組小鼠肝組織中可見大量棕黃色、棕褐色凋亡細胞核，肝細胞AI比正常組明顯升高〔(11.41±1.13)%，P<0.01〕；FMCL小、大劑量組肝細胞凋亡陽性細胞數目明顯減少，染色強度減弱，AI明顯降低〔(9.78±2.43)%、(7.96±1.84)%，P<0.01，P<0.05〕，并呈現劑量依賴關系，表明FMCL能明顯抑制酒精誘發的肝細胞凋亡，維生素E陽性對照組肝細胞AI為(7.64±2.23)%，較模型組明顯改善(P<0.01)。見圖1。

2.2FMCL對酒精引起小鼠肝組織病理學改變的保護作用各組小鼠肝組織切片HE染色后在光學顯微鏡下觀察：正常組，肝小葉結構清晰，肝細胞呈索狀排列，肝細胞無明顯病變；模型組，肝組織結構紊亂，肝小葉界限模糊，肝細胞明顯腫脹，胞質疏松化彌漫存在，并伴有肝細胞核濃縮、核碎裂，肝組織內有炎癥細胞浸潤；FMCL各劑量組，肝細胞胞質疏松化明顯減輕，細胞輕度腫脹，未見明顯的脂肪變性和炎癥細胞浸潤；維生素E陽性對照組，可見少量肝細胞胞質疏松化，肝細胞炎癥反應明顯減輕，肝細胞結構基本正常。見圖2。

圖1　FMCL對酒精性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響(TUNEL，×400)

圖2　FMCL對酒精性肝損傷小鼠肝細胞病理改變的影響(HE，×400)

2.3FMCL對酒精引起小鼠脂質過氧化的保護作用見表1。與正常組比較，模型組小鼠肝組織中MDA含量明顯升高，SOD、GSH活性明顯降低，表明急性酒精性肝損傷伴有顯著的脂質過氧化反應；而給予FMCL保護后，肝組織MDA含量明顯降低，SOD、GSH活性明顯升高，表明FMCL可提高內源性抗氧化劑的活性，具有明顯的清除自由基，抗脂質過氧化作用。

表1　FMCL對肝組織MDA含量及SOD、GSH

與正常組比較：1)P<0.01,與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

3討論

細胞凋亡又稱程序化細胞死亡(PCD)，是細胞在一定的生理或病理信號刺激下遵循自身程序，由基因控制的自主性死亡方式。凋亡與增殖的動態平衡是維系正常組織自穩態的一個基本過程。近年來研究發現細胞凋亡與各種肝臟疾病的發生密切相關，肝細胞的異常凋亡在酒精性肝病的發生與發展中起重要作用〔5〕。而促氧化物增多和抗氧化物減少造成的氧化應激是酒精性肝病肝細胞凋亡的主要機制之一〔6〕。

酒精介導的肝細胞凋亡在酒精性肝損傷的發病機制中扮演重要角色〔7〕。長期或大量飲酒時，酒精在肝微粒體經細胞色素P4502E1代謝時產生大量活性氧自由基(如O2-·、OH-·、C2H5O-·和C2H5OH-·等)，活性氧介導脂質過氧化連鎖反應，產生大量脂質過氧化終產物MDA，對肝細胞產生毒性，引起肝細胞凋亡。酒精在肝內代謝及活性氧的產生主要在線粒體，線粒體DNA對氧自由基攻擊高度敏感，可引起線粒體DNA廣泛缺失而形成線粒體DNA微環，并破碎成數百個微環碎片，是肝細胞發生凋亡的前提。活性氧還能改變線粒體膜滲透性，通過釋放凋亡相關蛋白細胞色素C和其他凋亡相關因子，活化Caspase蛋白與凋亡效應分子結合，誘導肝細胞發生凋亡。活性氧亦可活化NF-κB等信號通路，通過上調P53、Bax及Caspase-3等促凋亡因子基因的表達，介導肝細胞凋亡〔8，9〕。肝細胞凋亡可直接導致大量肝細胞的減少，并可激活肝組織炎癥和(或)壞死，最終導致肝功能嚴重損傷〔10〕。

正常肝組織內存在多種抗氧化物質，其中以SOD和GSH在抵抗酒精所致的肝損傷中起關鍵作用。SOD能有效清除自由基，保護細胞不受自由基侵害。GSH是肝細胞內游離存在的小分子抗氧化劑，能直接和氧自由基起反應，并作為谷胱甘肽過氧化物酶的特異性底物，還原體內已生成的自由基〔11〕。許多研究證實GSH等內源性抗氧化劑能夠對抗乙醇引起的肝細胞凋亡〔12，13〕。但是，當產生的活性氧自由基超過SOD、GSH等抗氧化因子的清除能力時，便可由氧應激損傷線粒體或活化促凋亡因子基因的表達，誘導肝細胞凋亡。因此，提高內源性抗氧化劑含量，清除自由基，抑制氧應激介導的肝細胞凋亡，是防治酒精性肝損傷的關鍵所在。

本研究結果表明小鼠急性酒精性肝損傷的形成是由于肝細胞異常凋亡所致，FMCL通過抑制肝細胞凋亡起到保肝護肝作用。FMCL能明顯降低酒精介導的脂質過氧化產物MDA含量的升高，明顯提高內源性抗氧化劑SOD、GSH的活性，具有較強的清除自由基的抗氧化能力。表明FMCL通過提高內源性抗氧化劑水平，抑制了氧化應激誘導的肝細胞異常凋亡，這可能是FMCL對酒精性肝損傷起保護作用的重要機制之一。

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〔2013-09-28修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)