葛根芩連湯對內毒素誘導的急性肺損傷小鼠的保護機制

葛根芩連湯對內毒素誘導的急性肺損傷小鼠的保護機制

姚金福樊湘澤楊子堯楊波范曉清

(長春中醫藥大學 ,吉林長春130117)

摘要〔〕目的探討葛根芩連湯對內毒素(LPS)誘導小鼠急性肺損傷(ALI)的保護作用。方法小鼠腹腔注射LPS(5 mg/kg)復制ALI動物模型。將小鼠隨機分為空白對照組、LPS組、地塞米松組(2 mg/kg)、葛根芩連湯低劑量組(6.5 g/kg)、葛根芩連湯高劑量組(13 g/kg)。觀察各組肺組織病理學改變,測量肺濕/干重比、丙二醛(MDA)、炎癥因子白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量及肺組織中Toll樣受體(TLR2)、TLR4與核因子(NF)-κB P65蛋白表達。結果葛根芩連湯可有效減輕LPS所致肺組織病理學變化，能降低肺泡灌洗液中炎癥細胞的數目，能顯著降低肺濕/干重比重并能降低減低TLR2、TLR4與NF-κB P65蛋白。結論葛根芩連湯可減輕LPS所致ALI，對LPS誘導的核因子有保護作用。

關鍵詞〔〕葛根芩連湯；炎癥；LPS-誘導急性肺損傷；TLR2；TLR4；NF-κB P65

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：吉林省中醫藥管理局資助項目(2012-074)

通訊作者：范曉清(1967-)，女，實驗師，主要從事分析化學、藥物化學的研究。

第一作者：姚金福(1960-) ，男，副教授，主要從事中醫學、中藥學研究。

急性肺損傷(ALI)是指嚴重感染、創傷、休克等打擊后,出現以肺泡毛細血管損傷導致肺水腫和肺不張為病理特征的一種肺部炎癥與通透性增加綜合征〔1〕。臨床資料分析發現,革蘭陰性桿菌膿毒癥是引起ALI,并導致其死亡的主要原因之一〔2〕。有時應用抗生素使細菌裂解和死亡后,可釋放更多的內毒素(LPS)〔3,4〕。Toll樣受體(TLR)是新近發現的跨膜信號傳導受體及病原模式識別受體,在感染性疾病中起重要作用。核因子(NF)-κB能引起一系列基因的表達增加,這些基因的產物則參與炎癥和免疫反應,從而使NF-κкB 轉導通路在ALI中發揮調節機制〔5~8〕。本研究旨在探討葛根芩連湯通過調節肺部TLR2、TLR4、NF-κBP65的作用機制，為ALI的診治提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物BABL/C小鼠，雌性，體重18~22 g，購自長春億斯實驗動物技術有限責任公司。動物批準文號：SCXK(吉)2014-0007。

1.1.2葛根芩連湯制備取葛根15 g，黃連9 g，黃芩9 g，甘草6 g購自吉林大藥房藥業股份有限公司，經長春中醫藥大學王德友教授鑒定為正品，加雙蒸水(1∶10)，煮沸2次。每次60 min，合并濾液，濃縮至浸膏，用時采用蒸餾水溶解配置成濃度1 g/ml的液體。

1.1.3試劑LPS(L2880，大腸桿菌055類型：B5，購自美國Sigma公司。由無菌水配制成儲備液1 mg/ml，-20℃避光保存，使用時用注射用生理鹽水配成0.5 mg/ml備用)。白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TLR2抗體、TLR4抗體，NF-κBP65抗體等試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.1.4儀器細胞計數儀(KX-21，美國SYSMEX)，倒置顯微鏡( OLYMPUS Sh1)。

1.2方法

1.2.1小鼠ALI模型復制及分組取小鼠50只,以25%氨基甲酸乙酯1 g/kg腹腔注射麻醉,隨機分成5組: 空白對照組(腹腔注射生理鹽水); LPS組(腹腔注射LPS,5 mg/kg),葛根芩連湯低劑量組(腹腔注射LPS前1 h給予葛根芩連湯,6.5 g/kg),葛根芩連湯高劑量組(腹腔注射LPS前1 h給葛根芩連湯,13g/kg),地塞米松組(予地塞米松2 mg/kg)每組10只小鼠。

1.2.2指標檢測

1.2.2.1肺組織濕/干重量比(g/g)取右上肺葉稱濕重,80℃ 恒溫箱烤48 h至干重恒定,稱干重,計算濕/干比。

1.2.2.2肺病理學檢查切取右肺,以4%的多聚甲醛固定,常規石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.2.2.3肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α檢測按照試劑盒方法進行檢測。

1.2.2.4Western 印跡將肺組織置于冰冷的裂解液中收集裂解物總蛋白，組織蛋白行SDS-PAGE并轉印至PVDF膜; 室溫封閉2 h，分別與TLR2、TLR4、NF-κB P65一抗孵育，膜經漂洗后再與辣根過氧化物酶偶聯的二抗反應，增強化學發光法(ECL) 發光試劑顯影，灰度成像軟件(UVP，UK) 測定主帶的光密度值以計算TLR2、TLR4、NF-κB P65蛋白表達水平。

2結果

2.1肺組織的病理學變化光鏡觀察顯示,空白對照組肺組織形態基本正常; LPS組肺泡毛細血管充血擴張,肺間質及肺泡間隔明顯增寬,炎性水腫,大量炎性細胞浸潤; 葛根芩連湯組上述變化明顯減輕,炎癥細胞浸潤和局灶性肺間隔增寬。見圖1。

2.2肺組織濕/干重比(g/g)與空白對照組(1.35±0.12)相比,LPS組(6.69±0.11)肺組織濕/干重比升高(P<0.05); 葛根芩連湯組可降低LPS所致肺組織濕/干重比的升高(低、高劑量分別為4.83±0.11、4.31±0.16)(P<0.05)，地塞米松組為3.12±0.15。

2.3肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量與空白對照組相比,LPS組肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較，葛根芩連湯組IL-6、TNF-α含量降低(P<0.05)，見表1。

2.4肺組織中P38MAPK和NF-κBP65蛋白水平與空白對照組相比,LPS組肺組織中TLR2，TLR4和NF-κB P65蛋白水平顯著升高(P<0.01)；與LPS組比較，葛根芩連湯組肺組織中TLR2，TLR4和NF-κBP65蛋白水平降低 (P<0.01)，見圖2。

表1　葛根芩連湯對IL-6和TNF-α的影響

與空白對照組比較:1)P<0.05;與LPS組比較:2)P<0.05;下圖同

圖1　葛根芩連湯提取液對LPS誘導小鼠ALT肺組織病變的影響(HE，×200)

A：空白對照組;B：LPS組; C：地塞米松組;D：葛根芩連湯低劑量組;E：葛根芩連湯高劑量組 圖2　肺組織TLR2，TLR4和NF-κB P65蛋白水平

3討論

ALI和急性呼吸窘迫綜合征ARDS是由多種炎性介質及效應細胞共同參與,并呈級聯放大的瀑布樣炎癥繼發性損傷與繼發性彌漫性肺實質損傷。目前除采用抗生素、腎上腺皮質激素、機械通氣及吸氧等措施外,尚無有效的治療藥物與方法。這促使我們尋找新藥物來治療ALI。

葛根芩連湯是經典古方之一,來源于東漢末年張仲景所著 《傷寒論 》第 34條：“太陽病,桂枝證,醫反下之,利遂不止,脈促者,表未解也,喘而汗出,葛根黃芩黃連湯主之”〔9〕。

本文發現葛根芩連湯發現能顯著減低模型小鼠肺泡灌洗液中的炎癥因子含量，降低肺組織中TLR2、TLR4和NF-κB P65蛋白水平，提示葛根芩連湯可能是通過調節TLR/NF-κB信號來達到抗急性肺損傷的。

參考文獻4

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9陳麗紅,唐于平,王強.葛根芩連湯的現代研究進展〔J〕.中草藥，2010；4(41)：8-12.

〔2014-05-17修回〕

(編輯徐杰)