褪黑素對(duì)糖尿病大鼠心肌熱休克蛋白70表達(dá)的影響

褪黑素對(duì)糖尿病大鼠心肌熱休克蛋白70表達(dá)的影響

韓雪1孟德欣孫權(quán)華鋒2王瑤2李若男3王亮4齊亞靈

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的研究褪黑素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織熱休克蛋白(HSP)70表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。方法高脂高糖飲食配合中等劑量鏈脲佐菌素腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，高劑量(20 mg/kg體重)和低劑量(10 mg/kg體重)褪黑素灌胃16 w，測(cè)量心臟重量，計(jì)算心臟指數(shù)；HE染色觀察心肌組織形態(tài)；免疫熒光檢測(cè)心肌HSP70含量。結(jié)果褪黑素對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量、心臟指數(shù)和血糖值的變化無影響。褪黑素可以下調(diào)HSP70在心肌的表達(dá)，改善心肌功能。結(jié)論褪黑素可以下調(diào)HSP70在糖尿病大鼠心肌的表達(dá)，對(duì)糖尿病大鼠心肌起保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕褪黑素；糖尿病；心肌；熱休克蛋白(HSP)70

中圖分類號(hào)〔〕R589.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(No.LZR2014_003)

通訊作者：齊亞靈(1967-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事基因診斷及生物治療研究。

1保山中醫(yī)藥高等專科學(xué)校

2佳木斯大學(xué)2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)

3佳木斯大學(xué)2010級(jí)預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)

4佳木斯大學(xué)2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)

孟德欣(1973-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病研究。

第一作者：韓雪(1982-)，女，在讀碩士，講師，主要從事糖尿病研究。

目前全世界糖尿病患者已經(jīng)超過2億，而我國(guó)糖尿病患者也超過7 000萬(wàn)〔1〕。糖尿病心肌病(DCM)是最終引起左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期心臟功能障礙的一種疾病狀態(tài)〔2〕。褪黑素(MT)是松果體分泌的激素之一，除具有調(diào)節(jié)睡眠、生殖及晝夜節(jié)律等生理功能外，還具有抗氧化活性，是一種高效自由基清除劑。本研究擬觀察褪黑素對(duì)糖尿病大鼠心肌組織熱休克蛋白(HSP)70表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料清潔級(jí)雄性Wistar大鼠60只，體重160~180 g(長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)；MT(浙江黃巖延年褪黑素有限公司)；HSP70多克隆抗體、FITC-羊抗兔、TRITC-IgG、山羊血清、DAPI染色液(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2模型的建立和分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量MT組、高劑量MT組，每組15只。模型對(duì)照組、低劑量MT組、高劑量MT組用50 mg/kg體重STZ腹腔注射配合高脂高糖飲食造成糖尿病模型，正常對(duì)照組注射枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。造模后72 h尾靜脈采血，空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。造模后每天10：00~14：00灌胃一次，MT組用1%MT生理鹽水懸濁液灌胃，低劑量MT組灌胃劑量為10 mg/kg體重，高劑量MT組灌胃劑量為20 mg/kg體重，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組用等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃16 w。

1.3標(biāo)本采集造模前后分別測(cè)大鼠空腹血糖，測(cè)量前禁食(不禁水)12 h，用愛先思血糖儀測(cè)量血糖值。每周測(cè)量大鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組部分大鼠沿心底大血管根部剪下心臟，生理鹽水沖洗，濾紙吸干，精確稱量心臟質(zhì)量，計(jì)算心臟指數(shù)(=心臟質(zhì)量/體質(zhì)量)，稱量后迅速將心臟放進(jìn)-80℃冰箱凍存；其余大鼠在體剪開右心耳，左心室進(jìn)針用50 ml注射器生理鹽水200 ml左右沖洗，直至右心耳流出無色液體，用4%多聚甲醛溶液灌注，直至四肢強(qiáng)直，沿心底大血管根部剪下心臟，10%中性甲醛溶液浸泡。

1.4HE染色和免疫熒光檢測(cè)將10%中性甲醛溶液固定的心肌組織制成5 μm厚石蠟切片，HE染色觀察心肌形態(tài)變化；石蠟切片脫蠟至水后，甲醇-過氧化氫溶液10 min滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)微波加熱抗原修復(fù)，山羊血清封閉37℃，20 min，一抗4℃過夜，二抗37℃，1 h，DAPI復(fù)染5 min，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、拍攝。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1一般狀態(tài)、體質(zhì)量和心臟指數(shù)正常對(duì)照組精神狀態(tài)良好，體重持續(xù)穩(wěn)定增長(zhǎng)，皮毛順滑潔白有光澤，無死亡；模型對(duì)照組精神萎靡，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展出現(xiàn)三多(多飲、多食、多尿)現(xiàn)象，體重下降，皮毛參差不齊、無光澤；MT組狀態(tài)與模型對(duì)照組相近。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組和MT組體質(zhì)量明顯下降(P<0.05)，心臟指數(shù)明顯增高(P<0.05)，低劑量MT組和高劑量MT組與模型對(duì)照組相比較，體質(zhì)量和心臟指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

2.2血糖變化與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組和MT組血糖值升高顯著(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，MT組血糖值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

表1　各組大鼠體質(zhì)量、心臟指數(shù)、空腹

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.3對(duì)心肌形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響正常對(duì)照組心肌間隙清晰可見，膠原纖維分布稀疏，著色淡，心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻。模型對(duì)照組心肌排列紊亂，腫脹，結(jié)構(gòu)不清，間質(zhì)及血管纖維組織增多，心肌細(xì)胞體積明顯增大，且大小不均，排列紊亂，胞質(zhì)豐富，胞質(zhì)顏色變淺，細(xì)胞核變?yōu)殚L(zhǎng)桿狀，排列紊亂，核膜皺縮，核固縮，個(gè)別呈雙核，染色質(zhì)邊聚于核膜下呈顆粒狀。MT組心肌間隙清晰，心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核形態(tài)正常，染色質(zhì)均勻，低劑量MT組較高劑量MT組明顯。見圖1。

2.4各組心肌HSP70蛋白表達(dá)免疫熒光灰度值比較與正常對(duì)照組(n=9,52.36±7.60)比較，模型組心肌HSP70蛋白含量(n=5，79.49±9.29)明顯升高(P<0.05)，與模型對(duì)照組比較，MT組心肌HSP70蛋白含量明顯降低(P<0.05)，低劑量MT和高劑量MT組(n=8,55.80±7.28;n=8,56.13±9.74)無顯著差別 (P>0.05)，見圖2。

圖1　各組心肌組織病理變化(HE，×400)

藍(lán)色示DAPI染色，紅色示HSP70 圖2　各組心肌HSP70蛋白表達(dá)(免疫熒光，×180)

3討論

糖尿病患者體內(nèi)的高血糖及高脂肪酸誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過量的活性氧簇(ROS)。包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)能夠啟動(dòng)熱應(yīng)激基因的表達(dá)，產(chǎn)生一組高度保守的HSP。其中HSP70在應(yīng)激反應(yīng)中具有敏感性，當(dāng)進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，機(jī)體通過對(duì)HSP70 mRNA的優(yōu)先翻譯和增強(qiáng)其穩(wěn)定性等調(diào)控機(jī)制的變化以適應(yīng)需要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HSP70蛋白含量與DCM發(fā)病具有一定相關(guān)性。這可能和HSP70的功能有關(guān)，作為分子伴侶，HSP70家族在應(yīng)激狀態(tài)下幫助需要折疊的蛋白質(zhì)正確折疊，加快正常蛋白質(zhì)合成的恢復(fù)；在細(xì)胞保護(hù)方面，HSP70表達(dá)增加可緩解細(xì)胞所受傷害，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)應(yīng)激的抵抗力；同時(shí)，HSP70在抗細(xì)胞凋亡、抗氧化和免疫反應(yīng)中也起重要作用〔3〕。

MT除具有調(diào)節(jié)睡眠、生殖及晝夜節(jié)律等生理功能外，還具有抗氧化活性，是一種高效自由基清除劑。其自由基清除能力是還原型谷胱甘肽的4倍，甘露醇的14倍〔4〕。本實(shí)驗(yàn)說明MT通過下調(diào)HSP70在心肌的表達(dá)途徑改善心肌功能。

參考文獻(xiàn)4

1翁建平.對(duì)糖尿病流行病學(xué)、循證醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)研究的探索〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2010；32(2)：166-71.

2Aneja A，Tang WH，Bansilal S，etal.Diabetic cardiomyopathy：insights into pathogenesis，diagnostic challenges，and therapeutic options〔J〕.Am J Med，2008；121(9)：48-57.

3任寶波，王玉艷，王純凈，等.HSP70家族的分類及基因結(jié)構(gòu)與功能〔J〕.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005；26(1)：98-101.

4Tan DX，Chen LD，Poeggeler B，etal.Melatonin：a potent，endogenous hydroxyl radical scavenger〔J〕.Endocrinol J，1993；1(1)：57-60.

〔2014-03-11修回〕

(編輯苑云杰)