人乳頭瘤病毒液態芯片基因分型和人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測的應用比較

人乳頭瘤病毒液態芯片基因分型和人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測的應用比較

陳勇周華蓉1黃玉秀2劉燦王文華陳永東馬躍飛

(福建醫科大學附屬第一醫院檢驗科，福建福州350005)

摘要〔〕目的研究人乳頭瘤病毒(HPV)液態芯片基因分型與HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸癌早期篩查、預后、治療中的應用。方法對680例患者進行HPV基因分型及E6/E7 mRNA檢測，評價這兩種方法對宮頸癌早期診斷、病變程度的效能。結果HPV液態芯片基因分型陽性檢出率為79.6%，HPV E6/E7 mRNA檢測陽性檢出率為35.3%，兩種方法陽性檢出率差異有統計學意義；在3個宮頸病理細胞學分級中，HPV液態芯片基因分型與HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性檢出率、敏感性、特異性、陽性預測值均具有統計學差異。結論宮頸癌篩查中，結合HPV液態芯片基因分型和HPV E6/E7mRNA檢測對臨床診療、疾病預后具有很好的價值。

關鍵詞〔〕宮頸腫瘤；DNA；mRNA；人乳頭狀病毒；芯片分析技術

中圖分類號〔〕R737.33〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：福建省教育廳科技項目(JA10145)；福建省衛生廳青年科研課題(2010-1-18)

1福建醫科大學附屬協和醫院血液科

2福建醫科大學附屬第一醫院婦產科

第一作者：陳勇(1977-)，男，副主任技師，碩士，主要從事分子生物學臨床診斷及法醫學鑒定研究。

宮頸癌是目前女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發生率有明顯上升和年輕化的趨勢〔1〕。現研究已表明，人乳頭瘤病毒(HPV)是宮頸癌發生發展的重要因素，在99.8%的宮頸癌患者中均可檢測到不同類別的HPV DNA〔2〕。迄今，已發現100多種HPV型，其中只有少數高危型的HPV易引起宮頸癌，高危型HPV(如HPV-16、18、31)與生殖道感染有關并且可以通過基因組整合入宿主細胞染色體中，引起細胞惡性轉化，從而使生殖系統癌變。HPV基因組的早期區編碼干擾細胞周期調控的E6/E7癌蛋白，高危型HPV的E6/E7癌蛋白能夠與宿主細胞靶向結合，并與轉錄活性有關。E6蛋白通過泛素途徑降解p53，因此在DNA受損傷時不能誘導細胞生長停滯或凋亡。E7結合pRB，p107，和p130，并使其降解，同時阻止Mi2組蛋白乙酰基轉移酶，誘導C-Myc，抑制TGFβ信號轉導通路。 HPV E6/E7的重要性已被人們所公認，通過HPV E6/E7 mRNA的定量檢測可直觀地了解宮頸細胞中HPV致癌基因表達的情況，為治療、預后提供可靠的評估工具。

1資料與方法

1.1研究對象收集2010年10月至2011年12月在我院婦產科門診及住院期間，因宮頸炎癥、白帶異常、陰道異常出血等原因就診，并自愿接受宮頸細胞學檢查、HPV DNA和mRNA檢測及宮頸組織病理檢查的婦女共680例，平均年齡為(39.5±13.4)歲，并對以上患者進行跟蹤隨訪。

1.2方法

1.2.1樣本采集使用窺陰器暴露宮頸，用新柏式公司的ThinPrep采樣器置于宮頸口，逆時針方向轉3圈，停留15 s，并存儲專用的標本瓶中，4℃保存1 w內檢測完畢。

1.2.2液基細胞學檢測使用新柏氏液基細胞學檢查系統對待檢樣本進行檢測。

細胞學標本使用2001年貝塞斯達(Bethesda)報告系統的標準〔3〕：①未見上皮內病變/惡性細胞(NILM)；②意義不明的非典型鱗狀上皮細胞(ASC-US)；③低度鱗狀上皮內病變(L-SIL)；④高度鱗狀上皮內病變(H-SIL)。少數ASC-H結果報告在H-SIL，而不典型腺細胞(AGC)報告一起入ASC-US組。

1.2.3HPV液態芯片基因分型使用上海透景公司的HPV分型檢測試劑盒，該試劑盒可以檢測26種HPV亞型，其中高危型19種分別為HPV 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、55、56、58、59、66、68、82、83；低危型7種分別為：6、11、40、42、44、61、73。使用美國Luminex公司最新一代的標準化高通量檢測技術平臺Luminex 200流式熒光平臺，采用專利的流式熒光技術，同時檢測26種HPV亞型，嚴格按照試劑盒說明書進行，所得到的數據經軟件分析后可以直接判斷結果。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA定量檢測使用美國IncellDx公司的 HPV OncoTect E6/E7 mRNA檢測試劑盒，可以一次性檢出13種高危型HPV型別的mRNA，分別為：HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型。取1 ml儲存于ThinPrep儲存液中的宮頸細胞學標本，將細胞離心沉淀和洗滌1次，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，pH值7.4，將細胞固定和透化在環境溫度下1 h。隨著固定和透化，將細胞洗滌2次，并沉淀離心。用針對13種高危型HPV的E6/E7全長的mRNA 的寡核苷酸探針進行原位雜交，然后將細胞重新懸浮在2%胎牛血清PBS中，使用IncellDx Goldfish流式細胞儀進行分析，所得到的數據經軟件分析后直接判讀結果。

1.3統計學方法采用SPSS17.0軟件行χ2檢驗，并計算HPV液態芯片基因分型與HPV E6/E7 mRNA的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值。

2結果

2.1HPV液態芯片基因分型和HPV E6/E7 mRNA檢測HPV液態芯片基因分型的陽性率為79.6%(541/680)，HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率為35.3%(240/680)。兩者差異顯著(χ2=296，P<0.05)。

2.2兩種方法對宮頸細胞學檢測的意義對680例樣本按細胞學分類進行分級，其中細胞學有異常的樣本共640例，對細胞學有異常的患者隨訪，根據陰道鏡及病理結果對HPV液態芯片基因分型和HPV E6/E7 mRNA檢測的結果比較，其陽性率、敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值見表1。

2.3兩種方法在不同階段對宮頸癌篩查的臨床應用根據美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)2011.1版的宮頸癌臨床實踐指南，結合本研究HPV液態基因芯片和HPV E6/E7mRNA檢測分析結果，可建立以下臨床診療圖譜，對臨床的診療及預后防治具有較好的價值。見圖1。

表1　HPV液態芯片基因分型和HPV E6/E7 mRNA檢測在細胞學異常的不同階段的檢測準確性分析

圖1　HPV DNA分型與HPV mRNA檢測在不同階段對 宮頸癌篩查的臨床應用

3討論

HPV是最小的DNA病毒，也是人類癌瘤發病中唯一可以完全確認的致癌病毒。依據HPV型別與癌發生危險性的高低分為低危型HPV和高危型HPV。低危型HPV如HPV6，11，42，43，44等，常引起外生殖器濕疣等良性病變，高危型HPV如HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68等，與宮頸癌及宮頸上皮內瘤變(CIN)的發生相關，但并不是所有的HPV 感染者都會進展為宮頸癌，在30歲以下(18~28歲)性生活活躍的年輕婦女中HPV感染機會在4%~15%，終身積累概率達60%以上，而多數的感染是“一過性”的，只是一種“一過性HPV攜帶狀態”，即多數女性可自行清除，平均時間是8個月〔4〕，只有持續的HPV感染才會發生CIN或宮頸癌，一般平均8~24個月可發生CIN，再平均8~12年可發生浸潤癌。HPV能否被消除，是否促成宮頸癌取決于：HPV的型別只有持續的高危型HPV感染才可能造成宮頸癌 宿主的免疫功能患者的產次、激素影響、營養狀況等其他性行為因素、性傳播疾病(STD)、重復HPV感染等。

本研究中HPV液態芯片檢測在宮頸癌篩查中顯示了較高的陽性率，其陽性率為79.6%，與相關的文獻基本相符〔5〕，可能是由于液態芯片分型基本涵蓋了中國人常見的HPV亞型，再加上檢測方法的靈敏度比較高，因而其能作為宮頸癌基本篩查的檢測手段，但HPV DNA檢測陽性只能反映HPV存在與否，并且大多數婦女感染只是一過性的，只有高危型的HPV持續感染才可能導致宮頸癌的發生，過高的陽性率反而會增加患者的心理負擔，因此若結合HPV mRNA檢測，就更能綜合地判斷患者的HPV感染綜合水平，這是由于HPV E6/E7 mRNA檢測更能反映HPV感染后致癌蛋白是否表達，其對臨床療效對比，疾病的預后具有重要意義。

本研究中顯示，2種方法在診斷的陽性率上都隨著3個病理分級的增高而增高，但HPV液態芯片基因分型陽性率增高的比較明顯，因此其在宮頸癌普查上具有重要的意義；在診斷的敏感性上，2種方法均具有較高的敏感性，但隨著病理級別的增高沒有明顯的改變，因此這兩種方法都可以用于宮頸癌篩查，而除了在ASC-US分級上兩種方法沒有統計學差異外，其他以上分級均具有統計學差異；在診斷的特異性上，HPV液態芯片基因分型檢測隨著病理分級的增高而降低，相反，HPV E6/E7 mRNA檢測則隨著病理分級的增高而增高，2種方法在病理分級的3個階段均具有統計學差異，因此可以認為HPV E6/E7 mRNA檢測對宮頸癌早期篩查具有較高的特異性，這主要是由于HPV E6/E7 mRNA更能反映HPV在細胞內是否表達，以及表達的量；在陽性預測值上，HPV E6/E7 mRNA檢測的結果均大于HPV液態芯片基因分型，在統計學上具有差異，這與相關文獻的報道相符〔6〕。

在本研究中HPV E6/E7 mRNA的檢測顯示比HPV DNA檢測更高的特異性，當用作分流篩查中，其測定能大大減少了陰道鏡的轉診檢查，提高檢測的效率。本研究結果顯示這兩種檢測方法的陰性預測值較為接近，陽性預測值HPV mRNA定量檢測高于HPV液態芯片分型，可以避免臨床不必要的陰道鏡檢查，給臨床醫生提供更有價值的檢測結果，可以指導臨床用藥及效果對比，有助于改善患者的診療質量。本研究通過分析兩種方法的臨床比較研究，結合NCCN2011.1版的宮頸癌臨床實踐指南，建立適合于我國的宮頸癌篩查指南，為臨床提供更為有效的篩查方法，對降低宮頸癌的發病率、死亡率提供更為有效的手段。

參考文獻4

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5盧文波，姜智南，陳順美，等.單一時間點HC2-HPV-DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測的臨床研究〔J〕.中華實驗和臨床病毒學雜志，2009；23(5)：378-80.

6Spathis A，Kottaridi C，Chranioti A，etal.mRNA and DNA detection of human papillomaviruses in women of all ages attending two colposcopy clinics〔J〕.PloS One，2012；7(11)：e49205.

〔2013-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)