EGCG對刀豆蛋白A誘導肝損傷小鼠CXCR3表達的影響

EGCG對刀豆蛋白A誘導肝損傷小鼠CXCR3表達的影響

劉冬梅張晶孫玥

(中國醫科大學附屬盛京醫院風濕免疫科，遼寧沈陽110004)

摘要〔〕目的觀察EGCG對刀豆蛋白A(ConA)誘導的肝損傷小鼠肝組織中CXCR3表達的影響。方法C57BL/6小鼠分成4組：正常對照組、表沒食子兒茶素酸酯(EGCG)對照組、ConA模型組，EGCG+ConA模型組。EGCG對照組及EGCG+ConA模型組小鼠造模前給予EGCG口服(5 mg/kg)，10 d后兩組模型組小鼠通過靜脈注射ConA(15 mg/kg)建造肝損傷模型，采血及留取肝組織，HE法檢測肝組織病理變化，ELISA法檢測腫瘤壞死因子(TNF)α，干擾素(IFN)-γ及CXCR3的水平，免疫組化法檢測肝組織中CXCR3的表達。結果ConA模型組小鼠肝損傷明顯，TNF-α、IFN-γ及CXCR3的表達明顯增多，與其他組比較有差異顯著(P<0.05)；EGCG干預的模型組肝損傷減輕伴TNF-α、IFN-γ及CXCR3的表達下降，與ConA模型組比較差異明顯(P<0.05)。免疫組化結果同樣顯示ConA模型組CXCR3的表達明顯增多，EGCG治療后表達減少。結論EGCG對ConA誘導的免疫性肝損傷小鼠有保護作用，其機制可能與調節CXCR3的表達有關。

關鍵詞〔〕EGCG；刀豆蛋白A；肝損傷；CXCR3

中圖分類號〔〕R575.1〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：劉冬梅(1975-)，女，副主任醫師，博士，主要從事自身免疫性疾病研究。

植物凝集素刀豆蛋白A(ConA)誘導的實驗小鼠肝損傷模型與人類自身免疫性肝炎(AIH)及病毒性肝炎類似，以肝臟聚集CD4+T細胞為主，介導了肝臟的免疫性損傷〔1〕。近年來，趨化因子受體及其家族在炎性疾病中的作用越來越受到人們的關注，其中CXCR3是一類較具代表性的趨化因子。有研究發現，許多慢性肝臟疾病中CXCR3相關配體CXCL10顯著升高。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從綠茶中提取的一種多酚化合物。研究表明EGCG具有抗炎、抗氧化、抗癌等諸多藥理活性，最近有結果顯示， EGCG能夠通過抑制相關炎癥因子的表達減輕ConA誘導的急性肝損傷，但其具體的作用機制并不明了〔2〕。本實驗采用靜脈注射ConA誘導C57BL/6小鼠建立肝損傷動物模型，給予EGCG進行干預，觀察EGCG對小鼠的肝保護作用及對肝組織中CXCR3表達的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物與主要試劑C57BL/6小鼠(中國醫科大學動物部)；Con A及EGCG (Sigma公司)；ELISA試劑盒 (上海信然生物公司)；CXCR3單克隆抗體(Zymed公司)。

1.2動物模型的建立及分組C57BL/6小鼠分4組：正常對照組、EGCG對照組、ConA模型組及EGCG+ConA模型組。EGCG對照組和EGCG+ConA組每天經灌胃給予5 mg/kg的EGCG，2次/d，共10 d，正常對照組和模型組同時給予等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)。10 d后，模型組和EGCG+ConA組小鼠經尾靜脈注射給予15 mg/kg的ConA，正常對照組和EGCG對照組同時給予等體積的PBS，注射10 h后取各組小鼠外周血并處死取肝組織。

1.3小鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)檢測小鼠麻醉后，摘眼球取血，離心后取上層血清，全自動生化儀法檢測小鼠血清ALT、AST的水平。

1.4酶聯免疫法(ELISA)法檢測小鼠肝組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ及CXCR3的水平處死小鼠后留取肝組織ELISA法檢測TNF-α、IFN-r及CXCR3的水平。具體參照ELISA說明書進行。

1.5HE染色小鼠麻醉后，無菌取肝臟組織，10%中性甲醛液浸泡，制作成蠟塊，包埋、切片、脫蠟至水、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、自來水反藍、伊紅染色、后進行脫水、透明、封片，最后顯微鏡下觀察染色效果，并于200倍下拍照。

1.6免疫組化法檢測CXCR3在小鼠肝組織的表達切片常規脫蠟至水,高溫高壓組織抗原修復,CXCR3抗體按1∶200稀釋,常規脫蠟、水化、微波恢復抗原,DAB顯色,常規復染封片，用彩色病理圖像分析系統采集圖像，在高倍鏡(×200)下檢測,以細胞質、核膜或胞膜呈現棕黃色顆粒為陽性細胞。

1.7統計學方法采用SPSS13.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1EGCG對各組小鼠ALT、AST的影響ConA模型組小鼠ALT、AST、TNF-α、IFN-γ、CXCR3的水平均較正常對照組顯著升高(P<0.05)，提示出現了明顯的肝損傷。與ConA模型組小鼠比較，EGCG+ConA組ALT、AST的水平降低，肝損傷減輕(P<0.05)。見表1。

2.2各組小鼠肝組織中TNF-α、IFN-γ及CXCR3的表達ConA模型組小鼠肝臟TNF-α、IFN-γ、CXCR3的水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)，與ConA模型組比較，與肝損傷一致；經EGCG治療后小鼠上述指標明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.3肝臟結構光鏡下的改變正常對照組小鼠肝細胞形態正常，肝小葉結構完整，匯管區正常。EGCG對照組小鼠可見肝細胞形態基本正常，肝小葉結構完整，匯管區正常。ConA模型組小鼠(注射ConA 10 h)后可見肝細胞水腫，充血壞死，肝小葉結構破壞，可見灶性壞死及炎癥細胞浸潤。EGCG對照組小鼠肝細胞水腫，肝小葉結構可見，偶有不完整，匯管區可見炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.4免疫組化結果ConA模型組小鼠肝臟組織細胞內CXCR3的表達明顯多于正常對照組和EGCG對照組。 EGCG治療后CXCR3的表達較模型組減少。見圖2。

表1　各組小鼠血清ALT、AST、TNF-α、IFN-α及CXCR3的水平變化

與正常對照組比較：1)P<0.05，與ConA模型組比較：2)P<0.05

圖1　各組小鼠肝組織病理切片的變化(HE，×200)

圖2　CXCR3 在各組小鼠肝組織的表達(DAB，×200)

3討論

ConA可與循環中的巨噬細胞成分組合，活化肝內的T淋巴細胞，釋放炎癥介質，對肝細胞造成損傷，對肝臟有器官特異性，常用來建造免疫性肝損傷模型。

目前對于免疫性肝損傷的治療主要有糖皮質激素、免疫抑制劑等，而這些藥物由于嚴重的不良反應使應用受到限制。因此積極尋找一種新的治療方法和藥物具有重要的臨床意義。EGCG是茶多酚中含量較高的物質，也是兒茶素類化合物中生物學效應最強的一種，有報道EGCG通過抑制炎性因子的表達減輕了ConA誘導的肝損傷，而炎性因子TNF-α、IFN-γ在ConA誘導的肝損傷過程中具有舉足輕重的作用。本實驗結果發現經過EGCC治療的模型組小鼠無論是血清轉氨酶還是肝臟形態學改變均明顯減輕，同時TNF-α、IFN-γ的表達亦明顯減輕，與文獻報道一致。

趨化因子是一類可以激發白細胞趨化性的小分子分泌性蛋白質，能夠吸引中性粒細胞、單核/巨噬細胞等炎性細胞移動到炎癥灶，并增強炎性細胞的吞噬殺傷功能，直接參與炎癥過程，并且在肝臟免疫反應尤其是淋巴細胞歸巢的細胞間黏附過程中有重要的地位〔3〕。因此對ConA誘導的免疫性肝損傷趨化因子的測定可以間接判斷肝臟的損傷程度。IP-10 是新近發現的屬于CXC類的趨化因子，CXCR3 是目前發現的IP-10 的唯一受體，所以CXCR3是目前人們研究較多的一類趨化因子。近年研究發現: 在自身免疫性肝病、慢性丙型肝炎、乙型肝炎病毒感染動物模型中IP- 10、CXCR3 的分泌增加〔4~6〕，而CXCR3僅表達于TH1細胞〔7〕，并且與許多自身免疫性疾病相關。有實驗發現，PBC患者肝臟的門脈區有超過半數的CD4+T細胞表達CXCR3〔8〕。Chen等〔9〕在銀屑病皮損中，發現CXCR3 mRNA表達增多，其配體CXCL9-11的mRNA水平也明顯升高。Henneken等〔10〕在RA患者外周血B細胞中檢測到CXCR3水平升高，關節滑液中CXCL9、CXCL10水平亦明顯升高。還有人〔11〕在狼瘡性腎炎的腎組織細胞中也發現了高表達的CXCR3。

本實驗提示CXCR3參與肝損害的發生；而經EGCC治療的小鼠CXCR3的表達顯著下降，與轉氨酶及TNF-α、IFN-γ的變化及肝臟形態學變化趨勢一致，顯示了EGCC在減輕肝損傷的同時降低了肝臟中CXCR3的表達，進一步提示EGCC保護肝臟的作用可能與調節CXCR3的表達有關。

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〔2014-05-12修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)