槲皮素通過抑制核因子-κB表達誘導A549細胞凋亡

槲皮素通過抑制核因子-κB表達誘導A549細胞凋亡

袁玫王松1張増雷羅海龍2姜愛英

(牡丹江醫學院紅旗醫院呼吸內科，黑龍江牡丹江157011)

摘要〔〕目的觀察槲皮素對人肺腺癌A549細胞核因子(NF)-κB信號通路的影響，探討其誘導非小細胞肺癌(NSCLC)細胞凋亡的作用機制。方法體外培養A549細胞，實驗分為槲皮素組(給予終濃度為30 μg/ml槲皮素)、順鉑組(給予終濃度為3 μg/ml順鉑)及對照組〔給予等體積二甲基亞砜(DMSO)〕。采用ELISA法檢測Caspase-3濃度；采用免疫組化熒光染色檢測PARP裂解片段陽性細胞熒光強度；采用 Western印跡分析檢測NF-κB蛋白的相對表達強度。結果槲皮素可明顯升高Caspase-3濃度、增強多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)裂解片段陽性細胞熒光強度、抑制NF-κB的表達，與對照組差異顯著(P<0.05，P<0.01)。結論槲皮素可通過抑制NF-κB表達而誘導A549細胞凋亡，可能是其抗NSCLC的機制之一。

關鍵詞〔〕槲皮素；非小細胞肺癌；caspase-3；多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)片段

中圖分類號〔〕R585.5〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：姜愛英(1981-)，女，碩士，主要從事肺癌的分子靶向治療研究。

1牡丹江市腫瘤醫院內二科2牡丹江醫學院紅旗醫院神經內科

第一作者：袁玫(1973-)，女，副主任醫師，主要從事呼吸系統疾病發病機制及其藥物治療研究。

肺癌是目前世界各國常見的惡性腫瘤之一，并且是我國城鎮居民死亡的首位原因〔1〕。在肺癌的病理學分型中，80%為非小細胞癌(NSCLC)，包括腺癌、鱗狀上皮細胞癌和大細胞癌〔2〕。目前肺癌治療以手術為主，聯合放化療為輔，但是因老年人腫瘤患病率高，大部分人可能由于機體狀況差、腫瘤已存在轉移不能耐受及接受手術治療。且手術費用昂貴，化療不良反應嚴重，有些患者尤其老年人難以耐受。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，存在于銀杏等許多植物內，具有明確的抗感染、抗血小板聚集、抗氧化作用，并影響多種酶的活性〔3〕。關于槲皮素對肺癌的影響鮮見報道。本研究旨在觀察槲皮素對人肺腺癌A549 細胞核因子(NF)-κB信號通路的影響，探討其誘導NSCLC細胞凋亡的作用機制。

1材料與方法

1.1材料與試劑人肺腺癌A549細胞購自中科院上海細胞庫；DMEM培養基購自美國HyClone公司；槲皮素(純度>99%)、順鉑、牛血清白蛋白(BSA)及二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Caspase-3 ELISA試劑盒購自美國Cayman Chemical公司；兔抗大鼠多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)片段的多克隆抗體購自eBioscience公司，Dylight488-山羊抗兔IgG購自美國Abbkine公司。

1.2試驗藥物槲皮素溶解于DMSO，配成30 μg/ml溶液，-20℃保存，備用。

1.3細胞培養與分組A549細胞保存在含有10% BSA的DMEM培養基(含L-谷氨酰胺，青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml)，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養。2~3 d傳代1次，收集對數生長期細胞接種于96孔板。實驗分為槲皮素組給予終濃度為30 μg/ml的槲皮素〔3〕；順鉑組給予終濃度為3 μg/ml的順鉑；對照組給予等體積DMSO(除未加槲皮素外，其余條件與實驗組完全一致)，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養繼續培養48 h后，用于后續實驗。

1.4ELISA檢測Caspase-3濃度各組A549細胞處理48 h后，加入預冷的1 mmol/L EDTA溶液(含1%BSA)，4℃ 2 000 r/min離心10 min，取沉渣加入100 μl 10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，冰浴超聲3×4 s后，4℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清。按照caspase-3 ELISA試劑盒說明書操作，Bio-R ad550型酶標儀450 nm處測定OD值。根據標準曲線求出Caspase-3濃度。

1.5PARP片段染色各組A549細胞處理48 h后，PBS洗滌3次，每次5 min。4%甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100通透30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。室溫1%BSA封閉1 h，加入兔抗大鼠PARP片段的多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min。加入Dylight488-山羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察并拍照，計算PARP片段蛋白熒光強度。

1.6Western印跡分析各組A549細胞處理48 h后，用細胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl，1.5% Triton X-100，150 mmol/L NaCl，10%甘油，1 mmol/L Na4P2O7，50 mmol/L NaF，1 mmol/L PMSF)和蛋白酶抑制劑(5 μmol/L AEBSF-HCl，5 μmol/L EDTA，10 mmol/L leupeptin，1.5 mmol/L E-64，pH7.4)裂解細胞后，收集裂解液，Bradford法測定蛋白質含量。取20 μg蛋白質加入等體積2×上樣緩沖液，95℃變性5 min。隨后進行7.5%SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后，電轉至0.45 μm硝酸纖維素膜，用含5%的脫脂奶粉PBST(25 mmol/L Tris pH7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween20)封閉1 h，加入NF-κB/p65兔源單克隆抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次5 min。加入HRP標記的二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，每次5 min。按同樣的方法與β-actin抗體孵育。化學發光試劑顯色，通過bio-rad凝膠成像進行目的條帶的表達檢測及分析。NF-κB/p65蛋白的相對表達強度=NF-κB/p65蛋白表達強度/蛋白表達強度β-actin。

1.7統計學方法采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2結果

2.1槲皮素對A549細胞Caspase-3濃度的影響槲皮素組和順鉑組Caspase-3濃度〔(21.35±5.27)μg/L和(25.76±5.92)μg/L〕明顯高于對照組〔(3.28±0.83)μg/L〕(P<0.05，P<0.01)；槲皮素組與順鉑組差異不顯著(P>0.05)。

2.2免疫組化結果PARP片段染色以核染為主，陽性細胞呈綠色熒光，槲皮素組和順鉑組PARP 片段陽性細胞數明顯較對照組增多，而對照組陽性細胞較少。見圖1。槲皮素組和順鉑組PARP 片段陽性細胞熒光強度〔(23.85±6.49)A.U和(35.71±8.16)A.U〕明顯高于對照組〔(11.26±3.84)A.U〕(P<0.05，P<0.01)；槲皮素組與順鉑組差異不顯著(P>0.05)。

圖1　各組PARP 片段免疫組化結果(×10)

2.3槲皮素對A549細胞NF-κB/p65蛋白水平的影響槲皮素組和順鉑組NF-κB/p65蛋白水平〔(0.87±0.21)和(0.92±0.29)〕明顯高于對照組(0.37±0.08)(P<0.05，P<0.01)；槲皮素組與順鉑組差異不顯著(P>0.05)。見圖2。

圖2　槲皮素對A549細胞NF-κB/p65蛋白水平的影響

3討論

機體維持各種細胞的平衡主要是通過細胞增殖與凋亡來實現的，這種平衡的維系一旦被打破可能引起一些疾病的發生，例如腫瘤。腫瘤細胞凋亡的抑制是腫瘤發生、發展的一個非常重要的因素，故此誘導腫瘤細胞的凋亡必定是治療腫瘤的中藥手段之一。NF-κB是一種具有多向調節功能的轉錄因子，NF-κB活化后可以誘導惡性腫瘤細胞產生抗凋亡蛋白，并且減少凋亡相關蛋白的表達量，提示NF-κB在惡性腫瘤進程中起抗凋亡作用，是目前肺癌研究的熱點〔4〕。NF-κB通常以同源或異源二聚體形式出現，其中以p50/p65分布和作用最廣泛，p50是NF與DNA結合的部分，p65是與抑制蛋白結合的部分〔5〕。由于p65參與基因轉錄的起始調節，并可促進 p50 與 DNA 結合，其在細胞核內的表達一定程度上反映 NF-κB的活性〔6〕。本研究結果提示槲皮素誘導A549細胞凋亡與抑制NF-κB/p65表達有關。

Caspase-3廣泛表達于正常人體組織及多種腫瘤組織中，處于細胞凋亡的下游，正常情況下以無活性的形式存在，但是當細胞發生凋亡時其變為活性形式，是執行細胞凋亡的主要酶類，絕大部分細胞凋亡依賴于該酶的存在，Caspase-3一旦激活，凋亡便不可逆轉地發生〔6，7〕。Caspase-3激活可誘導白血病細胞、結腸癌細胞、NSCLC細胞凋亡〔8~11〕。本研究說明槲皮素可能通過激活Caspase-3而誘導NSCLCA549細胞凋亡。

PARP為Caspase-3的底物，因caspase-3的活化將導致細胞發生凋亡性死亡，所以PARP又被稱為“死亡底物”〔12〕。PARP是真核細胞內具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基催化活性的蛋白酶，具有維持染色體穩定、DNA損傷修復、基因轉錄、細胞增長、死亡和凋亡等作用。PARP作為caspase-3的底物參與凋亡，PARP被caspase-3剪切為25 kD和89 kD大小的2個片段，PARP活性消失，喪失DNA修復功能，導致DNA損傷以及細胞凋亡〔13〕，PARP片段可以作為細胞凋亡的分子標志。Nakajima等〔14〕實驗表明，PARP 可與NF-κB形成復合物，從而使NF-κB DNA 結合位點暴露然后轉位于細胞核，上調細胞黏附分子等依賴NF-κB基因的轉錄，使其表達增加。本研究結果說明槲皮素可使PARP的裂解增加，表達降低。

綜上，槲皮素抗NSCLC的機制可能是：①槲皮素通過激活Caspase-3蛋白，將PARP切割降解，從而使具有DNA修復功能的PARP失去修復DNA的功能誘導A549細胞凋亡；②槲皮素使PARP裂解增加，表達降低從而抑制NF-κB基因轉錄，表達降低促進A549細胞凋亡。至于槲皮素是否通過其他機制誘導A549細胞凋亡，例如基質金屬蛋白酶-2和-9，還待進一步研究。

參考文獻4

1黃震洲，張旭.中西醫結合治療肺癌的研究進展〔J〕.中醫藥信息，2012；29(3)：129-32.

2茍云久，何曉東，謝定雄，等.非小細胞肺癌組織中CD133表達及臨床意義的Meta分析〔J〕.中國組織工程研究，2013；17(23)：4292-8.

3羅進勇，李林，尹一兵.槲皮素對人肺腺癌A549細胞增殖和凋亡的影響〔J〕.重慶醫學，2005；34(4)：551-2.

4蘭四友，蔣幼凡.肺癌組織中NF-κB-p65mRNA與CD15s蛋白的表達〔J〕.環境與健康雜志，2011；28(6)：512-4.

5馮繽，馮起校.NF-κB-在肺癌中作用的研究進展〔J〕.職業與健康，2011；27(13)：1540-1.

6蔡莉，王婭蘭，林曉.PARP抑制與小鼠結腸癌CT26細胞生長活性的關系〔J〕.重慶醫科大學學報，2008；33(2)：136-9.

7萬巧鳳，吳莉，楊美玲，等.槲皮素對甲型H1N1流感病毒誘導的A549細胞凋亡效應酶Caspase-3的影響〔J〕.中國中醫藥信息雜志，2011；18(10)：42-4.

8魏紹斌，要永卿，王毅，等.盆炎康栓對慢性盆腔炎模型大鼠子宮內膜細胞NF-κB、Caspase-3、MMP-2表達的影響〔J〕.中國中醫藥信息雜志，2006；13(3)：31-3.

9蒲俏虹，吳清清，金小寶，等.格列衛激活caspase-3誘導K562細胞凋亡〔J〕.藥學學報，2014；49(8)：1124-9.

10楊雨，徐文娟，彭康，等.穗花杉雙黃酮通過影響caspase-3和β-catenin表達誘導結腸癌細胞SW480凋亡〔J〕.南方醫科大學學報，2014；34(7)：1035-8.

11張黎黎，張潔，張林，等.p53、bcl-2、caspase-3在非小細胞肺癌組織中的表達及相關性分析〔J〕.天津醫藥，2014；42(7)：670-3.

12陳洪雷，高俊，梁素美，等.人肺癌組織中caspase-3及其底物PARP 蛋白的表達和意義〔J〕.武漢大學學報(醫學版)，2005；26(6)：726-30.

13龍建飛，張弛，張秋霞，等.黃連解毒湯有效部位對腦缺血大鼠半暗帶神經元NeuN、caspase-3、PARP 表達的影響〔J〕.北京中醫藥大學學報，2014；37(2)：90-5.

14Nakajima H，Nagaso H，Kakui N，etal.Critical role of the automodification of poly (ADP-ribose) polymerase-1 in nuclear factor-kappaB-dependent gene expression in primary cultured mouse glial cells〔J〕.J Biol Chem，2004；279(41)：42774-86.

〔2014-03-19修回〕

(編輯苑云杰)