莪術多糖對Lewis肺癌小鼠的抑制作用及機制

莪術多糖對Lewis肺癌小鼠的抑制作用及機制

陳志強張英志

(桐鄉市第一人民醫院呼吸科,浙江桐鄉314500)

摘要〔〕目的探討莪術多糖(CZP)對小鼠Lewis肺癌的抑制作用及可能機制。方法5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測CZP對Lewis肺癌細胞體外生長的抑制作用及對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響，中性紅比色法檢測CZP對小鼠脾巨噬細胞吞噬活性的影響；建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型，檢測CZP對Lewis 肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長、臟器指數及細胞免疫因子的影響。結果體外實驗表明，CZP對Lewis肺癌細胞生長具有顯著抑制作用，能顯著增強淋巴細胞增殖能力和巨噬細胞吞噬活性(P<0.05或P<0.01)；體內實驗表明，CZP對Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤率分別為26.9%、31.9%和39.7%，荷瘤小鼠脾臟指數、白細胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ水平均顯著提高(P<0.05或P<0.01)。結論CZP對小鼠Lewis肺癌具有抑制作用，可改善Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫功能，通過激活機體免疫系統實現有效的抗腫瘤作用和免疫調節功能。

關鍵詞〔〕莪術多糖；Lewis肺癌；免疫功能

中圖分類號〔〕R734〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：嘉興市科技局項目(2012AY1070-1)

通訊作者：張英志(1984-)，男，主治醫師，主要從事肺癌放化療研究。

第一作者：陳志強(1975-)，男，主治醫師，主要從事肺癌的分子細胞學機制研究。

莪術為姜科姜黃屬多年生草本植物，為傳統中藥材之一，應用歷史悠久，具有抗腫瘤、抗菌、保肝、升高白細胞等作用〔1〕。莪術中的主要活性成分包括莪術油、莪術醇等〔2，3〕，而關于莪術多糖(CZP)的研究報道較少。鑒于已有大量關于植物多糖具有抗腫瘤活性的報道〔4〕，本文以莪術的水溶性成分CZP為研究對象，開展對小鼠Lewis肺癌的抑制作用及機制的相關研究，為后續的藥物研發奠定相關基礎。

1材料與方法

1.1試藥CZP為本實驗室自制；環磷酰胺、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和胎牛血清購制美國Sigma公司；白細胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α和干擾素(IFN)-γ測定試劑盒購自美國R&D公司；其它試劑為國產分析純。

1.2瘤株與實驗動物Lewis肺癌細胞購于北京協和醫科大學細胞庫；6~8周齡C57BL/6J小鼠，體重(20.0±2.0)g，由浙江大學實驗中心提供。

1.3方法

1.3.1MTT法檢測細胞增殖用DMEM/F12培養液(10%小牛血清)培養Lewis肺癌細胞至對數生長期，用胰蛋白酶(0.25%)消化，調整細胞密度至1×105/ml，接種于96孔板中，每孔體積為100 μl，設對照組，環磷酰胺(CTX，25 μg/ml)組，50、100、200 μg/ml CZP給藥組，每組設3個復孔，分別培養24、48和72 h。在培養結束前4 h，于每孔內加5 mg/ml的MTT溶液15 μl，混勻后繼續孵育4 h，棄上清，加DMSO 150 μl，混勻后用酶標儀測492 nm處吸光度(A)值，計算抑制率。

1.3.2MTT法檢測CZP對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響采用常規方法制備C57BL/6J小鼠脾淋巴細胞，設對照組、50、100、200 μg/ml CZP給藥組，每組設3個復孔，5 μg/ml Con A和10 μg/ml LPS組，其他步驟同上，培養48 h，MTT法測492 nm處A值，計算相對增殖率。

1.3.3吞噬中性紅法測定小鼠脾巨噬細胞活性常規方法制備正常C57BL/6J小鼠脾巨噬細胞，RPMI 1640培養液調整細胞密度為1×106/孔，加入96孔板中，每孔100 μl。設對照組、50、100、200 μg/ml CZP給藥組，每組設3個復孔，終體積為每孔200 μl。細胞培養48 h后，每孔吸棄100 μl上清，然后加入中性紅溶液100 μl，培養30 min，離心，棄上清，用PBS洗3次，加200 μl裂解液室溫過夜，測589 nm處A值，計算吞噬率。

1.3.4體內抗腫瘤實驗取接種14 d、生長良好的Lewis肺癌細胞，在冰浴條件下以生理鹽水稀釋成1×107/ml的細胞懸液，以每只0.2 ml細胞懸液接種于小鼠右腋皮下。隨機分為對照組，CTX 25 mg/kg組，CZP低、中、高劑量(50、100、200 mg/kg)組，每組8只，雌雄各半。CZP以生理鹽水作為溶劑，每天腹腔注射1次，注射劑量均為0.2 ml，連續給藥21 d。末次給藥24 h后，稱小鼠體質量，眼球取血，制備血清，-20℃儲存備用。頸椎脫臼處死小鼠，取脾臟、肺臟、腎臟及瘤塊，計算脾臟指數、腎臟指數、肺臟指數及抑瘤率。

1.3.5酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測小鼠血清中免疫分子水平按照商品化的試劑盒說明書中的操作步驟，采用間接ELISA法檢測小鼠血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ含量。

2結果

2.1CZP對Lewis肺癌細胞增殖的影響各劑量組對Lewis肺癌細胞的增殖均有明顯的抑制作用(P0.01)，且具有劑量依賴效應；同時，隨著作用時間的延長，抑制作用明顯增強，具有時間依賴效應。見圖1。

2.2CZP對小鼠脾淋巴細胞增殖和巨噬細胞吞噬活性的影響與對照組相比，CZP各劑量組小鼠脾淋巴細胞增殖活性均顯著增高(P<0.05或P<0.01)，而與Con A組和LPS組無顯著差異(P>0.05)；CZP對小鼠巨噬細胞吞噬活性有促進作用，與對照組相比差異顯著(P<0.05或P<0.01)，見表1。

2.3CZP對荷瘤小鼠脾臟、腎臟、肺臟指數的影響CTX可以顯著降低荷瘤小鼠脾臟指數(P<0.05)，而低、中、高劑量的CZP均可以顯著提升荷瘤小鼠脾臟指數(P<0.05 或P<0.01)；而無論是CTX還是CZP給藥組，對荷瘤小鼠腎臟及肺臟指數均無顯著性影響(P>0.05)。見圖2。

與對照組比較：1)P<0.01，表2同 圖1　CZP對Lewis肺癌細胞增殖的影響(x-±s，n=3)

組別劑量(μg/ml) 脾淋巴細胞 巨噬細胞 吸光度(A)淋巴細胞增殖率(%)吸光度(A)巨噬細胞吞噬率(%)對照組-1.01±0.11100.00.53±0.04100.0CZP組501.13±0.09118.81)0.66±0.05124.51)1001.37±0.08135.62)0.82±0.09154.72)2001.55±0.17152.52)0.95±0.13179.22)ConA組51.76±0.13174.22)--LPS組101.59±0.12157.42)--

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；圖2同

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01 圖2　CZP對Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟指數、腎臟指數和 肺臟指數的影響(x-±s，n=8)

2.4CZP對小鼠Lewis肺癌生長的影響CTX對小鼠Lewis肺癌生長的抑制作用最為明顯，抑制率高達61.4%；各劑量組的CZP對Lewis肺癌的生長也具有明顯的抑制，抑制率分別為26.9%、31.9%和39.7%，與對照組比較差異顯著(P<0.05)。

2.5CZP對荷瘤小鼠血清免疫因子的影響與對照組相比，CTX組小鼠血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平與對照組比較顯著降低(P<0.05 或P<0.01)。而低、中、高劑量的CZP均可顯提升IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平(P<0.01)，見表2。

表2CZP對Lewis荷瘤小鼠血清免疫因子的影響

組別劑量(mg/kg)IL-2TNF-αIFN-γ對照組-94.53±9.7359.83±8.0211.44±1.68CTX2541.29±7.051)41.27±6.841)5.32±0.911)CZP5098.75±13.191)73.14±9.951)16.46±2.281)100129.64±13.721)92.37±10.261)19.72±2.121)200145.93±15.371)129.72±11.891)21.29±1.351)

3討論

惡性腫瘤嚴重威脅人類健康和生命，其發病率和死亡率在許多國家和地區均高居首位。近年來，隨著抗腫瘤新藥的不斷涌現，使腫瘤化療同放療和手術治療一樣，成為治療腫瘤的重要手段之一〔5〕。但現有的化療藥物對大多數實體瘤的療效不甚理想，加之在應用過程中伴隨著耐藥性和較嚴重的副作用，使得研究人員迫切希望找到低毒、高效的抗腫瘤藥物。鑒于中醫藥在治療癌癥方面有其獨到之處，從傳統中藥材中篩選抗腫瘤活性成分以及抗腫瘤先導化合物已成為該領域的研究焦點〔6〕。目前，來源于植物藥的抗癌制劑已占總抗癌藥物的30%以上，其中紫杉醇、長春新堿、喜樹堿等已成為許多腫瘤化療的首選藥〔7〕。我國藥用植物資源極為豐富，從傳統中藥中篩選抗腫瘤有效成分，并明確其抗腫瘤作用及機制，對于抗腫瘤藥物的開發具有非常重要的意義。

植物多糖的抗腫瘤作用與免疫功能的改善密切相關〔8〕。采用MTT及吞噬中性紅法分別檢測CZP對淋巴細胞增殖能力和巨噬細胞吞噬活性的影響，發現CZP具有增強淋巴細胞增殖能力和巨噬細胞吞噬活性的作用；同時，通過體內實驗也證實，CZP具有增加荷瘤小鼠脾臟指數的作用。腫瘤發生時，在分子水平上機體內IL-2、TNF-α及IFN-γ等免疫因子表達增多，從而提高免疫功能而發揮抗腫瘤作用。IL-2是細胞因子網絡的重要成員，具有促進淋巴細胞分裂、增強對殺傷細胞的殺傷作用和輔助抗體生成等生物學功能〔9〕。TNF-α是來源于活化的單核細胞，具有凋亡、壞死、激活淋巴細胞因子等各種抗腫瘤活性；同時，TNF-α可以與IL-2等相互作用從而發揮一系列的免疫作用〔10〕。IFN-γ是調節免疫系統的主要細胞因子，作用于免疫系統的多個環節，其作用主要為激活巨噬細胞和上調主要組織相容性復合體(MHC)分子的表達〔11〕。本研究結果表明CZP可以通過提高免疫因子水平從而起到抑制Lewis肺癌的作用。

綜上所述，CZP對小鼠Lewis肺癌具有抑制作用，可改善Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫功能，通過激活機體免疫系統實現有效的抗腫瘤作用和免疫調節功能。因此，CZP在未來有望作為一種低毒、高效的抗腫瘤成分，與一些化療藥物合用以提高患者的生活質量，具有良好的應用前景。

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〔2013-10-10修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)