不同劑量沙美特羅替卡松聯(lián)合川芎嗪對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺組織炎癥的影響

不同劑量沙美特羅替卡松聯(lián)合川芎嗪對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺組織炎癥的影響

金明哲熊瑛1

(重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院呼吸內科，重慶402160)

摘要〔〕目的 探討ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺部炎癥的干預作用。方法70只Wistar大鼠隨機分為對照組(A組)、模型組(B組)、川芎嗪組(C組)、中劑量ICS/LABA組(D組)、中劑量ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪組(E組)、高劑量ICS/LABA組(F組)、高劑量ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪組(G組)，每組10只。采用煙熏加氣管內注入脂多糖(LPS)法建立COPD模型。吸入ICS/LABA中、高2個劑量及川芎嗪腹腔注射進行干預。觀察大鼠肺功能及肺組織病理變化，流式細胞術測定血中CD4、CD8值，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定肺泡灌洗液(BALF)中轉化生長因子β1(TGF-β1)表達，免疫組化法測定肺組織中金屬基質蛋白酶-9(MMP-9)、分泌性白細胞蛋白酶抑制物(SLPI)的表達，RT-PCR法檢測肺組織中MMP-9 mRNA的表達。結果B組大鼠肺泡壁破壞，肺大皰形成，間質內大量炎性細胞浸潤，符合COPD肺組織病理改變，各干預組均有所減輕；B組大鼠MMP-9及其mRNA相對含量、TGF-β1濃度比A組大鼠顯著升高；CD4/CD8比A組大鼠明顯降低。經ICS/LABA及川芎嗪干預后，各組大鼠MMP-9及其mRNA相對含量、TGF-β1濃度與B組大鼠相比有明顯降低(P<0.05)；CD4/CD8、SLPI比B組大鼠有顯著提高(P<0.05)，以G組療效最明顯(P<0.05)。相關分析表明，MMP-9與第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)/用力肺活量(FVC)呈負相關(r=0.861 3，P<0.01)；SLPI與FEV0.3/FVC呈正相關(r=0.832 1，P<0.01)。結論ICS/LABA和川芎嗪均可抑制COPD大鼠肺部炎癥，高劑量ICS優(yōu)于低劑量ICS，且聯(lián)合用藥比單獨用藥療效顯著，其機制可能是通過降低TGF-β1、MMP-9水平并調節(jié)SLPI及CD4、CD8的表達而實現(xiàn)。

關鍵詞〔〕阻塞性肺疾病；轉化生長因子β1；金屬基質蛋白酶9；分泌性白細胞蛋白酶抑制物

中圖分類號〔〕R563.3〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：熊瑛(1954-)，女，教授，碩士生導師，主要從事哮喘及慢性阻塞性肺疾病研究。

1瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸一科

第一作者：金明哲(1988-)，男，碩士，主要從事慢性阻塞性肺疾病研究。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是嚴重影響人類健康的多發(fā)病之一，炎癥是其發(fā)病的核心機制，香煙及感染等有害刺激導致中性粒細胞、肺泡巨噬細胞等炎性細胞在氣道局部聚集，促進轉化生長因子-β1(TGF-β1)、基質金屬蛋白酶(MMP-9)等炎癥介質和細胞因子的釋放，并構成復雜的網絡系統(tǒng)〔1〕，使肺部大量炎癥細胞聚集、浸潤；并降低機體免疫能力及分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)的表達，使肺組織損傷與修復交替出現(xiàn)，最終引起肺組織破壞及纖維化。GOLD建議以高劑量吸入性糖皮質激素(ICS)聯(lián)合長效B2受體激動劑(LABA)為最佳方案，但長期大劑量應用ICS副作用大，炎癥控制不理想。研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，川芎嗪能抑制肺部炎性細胞的聚集、氧自由基的釋放，并可促進炎癥吸收，減輕肺部損害。ICS/LABA聯(lián)用川芎嗪對COPD肺部炎癥是否具有更好的調控作用，目前這方面的實驗研究還未見報道。本研究觀察不同劑量的ICS/LABA及聯(lián)用川芎嗪對COPD大鼠肺功能、肺組織中TGF-β1、MMP-9、SLPI及CD4/CD8表達改變，初步探討其對COPD動物模型肺部炎癥的調控作用。

1材料與方法

1.1動物模型復制SPF級健康雄性Wistar大鼠70只，平均體重(160±20)g(重慶鑫騰生物公司)。隨機分為對照組(A組)、模型組(B組)、川芎嗪組(C組)、中劑量ICS/LABA組(D組)、中劑量ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪組(E組)、高劑量ICS/LABA組(F組)、高劑量ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪組(G組)，每組10只。天下秀牌香煙(川渝中煙工業(yè)有限公司，焦油量10 mg，煙氣煙堿量0.8 mg)；LPS(美國，Sigma公司)；TGF-β1試劑盒(美國R&D公司)；ICS/LABA(舒利迭50 μg/250 μg、50 μg/500 μg，葛蘭素史克公司)；川芎嗪注射液(河南輔仁懷慶堂制藥有限公司)；動物肺功能儀(美國 Buxco公司)；SLPI抗體(美國 Bioworld Technology公司)；MMP-9抗體(北京博奧森公司)；Trizol RNA 提取試劑盒(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒 (美國MBI公司)。參照文獻〔3，4〕等所用方法復制動物模型，有所改良：B組大鼠在實驗第1、14天，向氣管內注入LPS(200 μg/200 μl)。分別在實驗第2～13天、第15～45天，將大鼠放入容積為60 L的自制密閉玻璃染毒箱(30 cm×40 cm×50 cm)內被動吸煙，方法為：將點燃的香煙通過玻璃孔將煙霧注入煙熏箱內，2次/d，每次15支，持續(xù)1 h，間隔4 h/組。各干預組造模方法同B組，于第16～45天煙熏前1 h開始干預，1次/d；C組以川芎嗪腹腔注射(80 mg/kg)；D組以舒利迭(50 μg/250 μg)滴鼻；E組以川芎嗪(80 mg/kg)腹腔注射、舒利迭(50 μg/250 μg)滴鼻；F組以舒利迭(50 μg/500 μg)滴鼻；G組以川芎嗪(80 mg/kg)腹腔注射、舒利迭(50 μg/500 μg)滴鼻；各組滴鼻方法為，舒利迭兩噴溶于1.7 ml生理鹽水+0.3 ml聚山梨酯-80，0.3 ml/只，2次/d，據(jù)文獻〔5〕，此劑量和成人每天1 mg相符；A組：各干預因素均以相同劑量生理鹽水代替，玻璃箱內吸入空氣。

1.2大鼠肺功能測定實驗第46天，以2%的戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉大鼠，氣管插管，放入體描箱，應用動物肺功能檢測儀〔6〕，測定呼氣峰流量(PEF)、第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)、FEV0.3/用力肺活量(FVC)。

1.3CD4、CD8數(shù)值的檢測剪開大鼠腹壁皮膚，暴露腹主動脈，以無菌采血器穿刺腹主動脈取血2 ml，裝入4 ml BD抗凝管內。搖勻后用流式細胞儀檢測血中CD4、CD8值。

1.4肺泡灌洗液(BALF)TGF-β1的檢測以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)進行右心室灌注，打開胸腔后夾閉右肺，以3 ml生理鹽水灌洗左肺，反復3次，總回收量約為7 ml，回收率為75%~80%。所回收的BALF采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測TGF-β1濃度，按照說明書操作。

1.5肺組織標本和形態(tài)定量分析取右肺中葉，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色；取右肺上葉，修剪成0.5 cm厚的塊狀，生理鹽水沖洗兩遍后，迅速放于液氮中。肺組織用2%四氧化鋨固定，切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛電子染色，應用圖像處理系統(tǒng)，測量肺平均內襯間隔(MLI)、肺泡破壞指數(shù)(DI)。

1.6肺組織SLPI和MMP-9檢測采用10%多聚甲醛固定各組大鼠右肺中葉，石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水，按MMP-9、SLPI免疫組化檢測試劑盒說明書操作，抗體濃度均為1∶100。每只大鼠取2張切片，應用HPIAS-1000病理圖文分析系統(tǒng)檢測每張切片10個視野的陽性系數(shù)。陽性系數(shù)的計算參見文獻〔7〕。

1.7RT-PCR法測定大鼠肺組織MMP-9 mRNA表達取肺組織標本30 mg，按照Trizol RNA提取試劑盒說明提取總RNA，逆轉錄成cDNA。以SYBR Green Ⅰ作為熒光標志物，應用熒光實時定量PCR儀進行PCR反應。根據(jù)GenBank的cDNA序列設計引物，以β-actin為內參照物(上海生工生物工程技術服務有限公司)。MMP-9正義引物：5'-CATCTGGGGATTGAACTCAG-3',反義引物：5'-GTGGTGTCCTCCGATGTAAG-3',擴增長度為235 bp。β-actin正義引物：5'-CCTAGACTTCGAGCAAGAGA-3',反義引物：5'-AGAGGTCTTTACGGATGTCA-3',擴增長度為221 bp。通過融解曲線和電泳結果確定目的條帶并分析，△△Ct法進行目的基因的相對定量。

2結果

2.1一般情況及組織病理學觀察B組大鼠均精神萎靡，少食，體毛干枯發(fā)黃，咳嗽及呼吸急促、口唇及四肢發(fā)紺、仰臥位呼吸，各干預組有不同程度好轉，制作模型時共死亡10只。光鏡下，A組肺組織無異常改變；B組大鼠各級支氣管明顯狹窄，氣道上皮復層化，杯狀上皮細胞增生，間質內有大量炎性細胞浸潤，肺泡壁破壞，肺泡腔擴大，部分破裂融合成肺大皰。干預組肺泡壁破壞程度和肺大皰數(shù)目較B組均有所減輕，炎性細胞浸潤減少。見圖1。

2.2大鼠肺功能與肺組織形態(tài)學結果與A組相比，B組大鼠PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC顯著降低，MLI和DI明顯增高(P<0.05)。各干預組大鼠PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC均明顯高于B組，MLI和DI顯著低于B組(均P<0.05)；干預組組間比較，G組變化明顯P<0.05)。見表1。

2.3大鼠血清CD4/CD8比較B組大鼠血清CD4/CD8的含量明顯低于A組(P<0.05)；各干預組CD4/CD8值明顯高于B組(P<0.05)。干預組組間比較，G組變化明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1　各組大鼠肺組織光鏡下形態(tài)觀察(HE，×100)

2.4BALF中TGF-β1表達水平B組TGF-β1濃度明顯高于A組(P<0.05)；各干預組TGF-β1濃度明顯低于B組(P<0.05)；干預組組間比較，G組變化明顯(P<0.05)。見表2。

2.5SLPI在大鼠肺組織的免疫組化表達SLPI在氣管、支氣管上皮細胞免疫染色呈強陽性，僅在細胞質和管腔側細胞膜著色(圖2)。A組SLPI呈現(xiàn)強陽性表達；B組為弱陽性表達，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；各干預組與B組相比，SLPI表達明顯增強，各組陽性系數(shù)與B組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；干預組組間比較，G組變化明顯(P<0.05)。見表2。

表1　大鼠肺功能與形態(tài)分析比較 ± s)

與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05；與G組比較：3)P<0.05；下表同

表2　大鼠血清CD4/CD8、BALF中TGF-β 1濃度、肺組織SLPI、MMP-9陽性系數(shù)及MMP-9 mRNA 相對含量的比較

圖2　各組大鼠SLPI的表達(DAB，×400)

2.6MMP-9在大鼠肺組織的免疫組化表達MMP-9在支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、等免疫染色呈強陽性，以胞質染色為主(圖3)。B組MMP-9強陽性表達；A組表達MMP-9呈弱陽性表達，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；各干預組MMP-9呈中度陽性表達，與B組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；干預組組間比較，G組變化明顯(P<0.05)。見表2。

圖3　各組大鼠MMP-9的表達(DAB，×400)

2.7大鼠肺組織中MMP-9 mRNA的表達與A組比較，B組大鼠肺組織中MMP-9 mRNA表達量明顯增高(P<0.05)；各干預組大鼠支氣管肺組織中MMP-9 mRNA表達量明顯比B組降低(P<0.05)；干預組組間比較，G組變化明顯(P<0.05)。見表2。

3討論

吸煙和反復呼吸道感染等導致的炎性介質與細胞因子瀑布可直接損傷氣道和肺組織，促使蛋白酶/抗蛋白酶、氧化/抗氧化失衡，從而使COPD氣道炎癥遷延不愈。本研究結果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、口唇及四肢發(fā)紺，肺功能FEV0.3/FVC明顯降低，光鏡下肺組織出現(xiàn)明顯炎癥浸潤、肺泡間隔斷裂、肺泡腔擴大、部分融合為肺大皰，MLI和DI顯著增加，說明動物模型復制成功〔8〕。

COPD是一種慢性炎癥性疾病，TGF-β1在其發(fā)病中起著重要作用，不僅促使成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，增加纖維黏蛋白和膠原的合成，并抑制膠原酶和蛋白酶的產生以減少膠原降解，導致氣道炎癥及纖維化，同時作為強效免疫抑制因子〔9〕，能抑制T/B淋巴細胞的增殖及免疫球蛋白的分泌，降低免疫水平，加重肺組織炎癥；此外TGF-β1可通過活化細胞內真核蛋白激酶信號途徑和上調轉錄因子Ets-1刺激足突細胞MMP-9 mRNA表達增加，MMP-9作為蛋白水解酶，可破壞肺泡基質成分，促使大量炎性細胞穿透基底膜屏障進入肺組織，釋放炎性因子，加重蛋白酶/抗蛋白酶失衡，使肺部炎癥呈聯(lián)級式爆發(fā)；同時TGF-β1還通過Smads信號通路抑制SLPI的表達和分泌〔10〕，SLPI作為氣道內最重要的保護基質，具有抗蛋白酶、抗炎、抗真菌活性，可抑制MMP-9的產生，減輕氣道炎癥；還能降低氣道中彈性蛋白酶水平，進而中斷炎癥循環(huán)；研究發(fā)現(xiàn)〔11〕,無論在急性發(fā)作期還是穩(wěn)定期，COPD患者肺泡灌洗液中CD4/CD8水平都呈下降狀態(tài)，導致免疫功能低下，進而加重COPD肺部炎癥反應。本研究結果與相關報道相一致〔12〕，提示炎性細胞因子在COPD肺部炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

舒利迭是丙酸氟替卡松和沙美特羅的復方制劑，分別作用于氣道炎癥的不同環(huán)節(jié)，可抑制多種炎性細胞的活化及炎性因子的生成；并能增強纖毛的清除能力，減輕氣道高反應性。在某些環(huán)節(jié)上更具有協(xié)同作用，ICS能減少β2受體的脫敏和耐藥性;而LABA可將糖皮質激素受體磷酸化,使受體對類固醇的刺激更敏感,進而增強抗炎效能。而川芎嗪可減輕氣道黏膜水腫，利于分泌物排出；能降低肺動脈壓和肺毛細血管內壓，減輕右心后負荷，改善機體缺氧狀態(tài)；還可提高超氧化物歧化酶含量，增強清除自由基的作用；同時可阻止免疫復合物的形成，抑制病原菌生長，促進炎癥吸收。

本研究結果說明在抑制COPD肺部炎癥方面，ICS/LABA聯(lián)合川芎嗪的療效優(yōu)于單一用藥，對減少肺組織的破壞，改善肺功能，調節(jié)肺部TGF-β1、MMP-9、SLPI的表達和分泌及增強機體免疫能力等方面均有較滿意的效果，這就提示，不管在COPD急性發(fā)作應用高劑量ICS/LABA，還是穩(wěn)定期降階梯應用中劑量ICS/LABA時，均可聯(lián)合應用川芎嗪治療，對增強機體免疫、保護肺功能、減少急性發(fā)作頻率和入院率，延緩COPD的發(fā)展可能具有更好的效果。

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12Theodore AO，Mark DE，Alexis R，etal.Matrix metalloproteinase-9 predicts pulmonary status declines in α1-antitrypsin deficiency〔J〕.Respir Res，2011;12(1):35.

〔2013-09-12修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

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