通心絡對大鼠血管平滑肌細胞BKCa通道的影響及作用機制

通心絡對大鼠血管平滑肌細胞BKCa通道的影響及作用機制

李暢

(瀘州醫學院心血管醫學研究所，四川瀘州646000)

摘要〔〕目的探討通心絡對大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)大電導鈣激活鉀通道(BKCa)的影響及作用機制。方法將30只10周齡的雄性SD大鼠隨機分為大劑量通心絡組(1.0 g·kg-1·d-1)、小劑量通心絡組(0.5 g·kg-1·d-1)和模型對照組，每組10只，經腹主動脈部分縮窄術制作高血壓大鼠模型，另選10只同齡SD大鼠作為正常對照組，采用酶消化法和貼塊法分離VSMC，采用膜片鉗技術記錄各組大鼠VSMC的BKCa通道開放概率(Po)、電流幅度值(Amp)、平均開放時間(To)和平均關閉時間(Tc)的變化。結果不同Ca2+濃度下的正常對照組和模型對照組的BKCa通道活性均明顯增強，呈顯著的濃度依賴性。Po以及To均隨著浴液Ca2+濃度的增加而增加，Tc隨著浴液Ca2+濃度的增加而縮短，浴液Ca2+濃度對BKCa通道的Amp影響不大；與正常對照組相比，模型對照組通道活性的改變更顯著(P<0.05)。保持浴液游離的Ca2+濃度為10-7 mol/L，鉗制電壓固定在+40 mV時，內面外向式的膜片下，模型對照組的Po水平顯著高于正常對照組，Tc顯著低于正常對照組；大、小劑量的通心絡組的Po及To的水平均顯著高于模型對照組，Tc顯著低于模型對照組；大劑量通心絡組的Po及To的水平比小劑量通心絡組更高，Tc的水平更低(均P<0.05)。結論通心絡能夠激活大鼠VSMC的BKCa通道，能擴張血管。

關鍵詞〔〕通心絡；大電導鈣激活鉀通道；血管平滑肌細胞

中圖分類號〔〕R54〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：李暢(1983-)，女，在讀碩士，主要從事心血管電生理方面的研究。

通心絡具有通絡止痛、活血益氣、改善血脂代謝、動脈僵硬和血液高凝狀態等作用〔1〕。但通心絡治療血管擴張性疾病的功效研究不多，高血壓在宏觀上表現為心機重量及心室壁增厚，在組織上表現為心肌細胞肥大及纖維化，其中心肌間質及心肌內冠脈小血管周圍的膠原過度的沉積和增多表現最明顯，阻力血管肥厚是高血壓的主要病理特征，同時是高血壓心、腎、腦靶器官損害的一個病理基礎。本次實驗采用腹主動脈部分縮窄術建立大鼠心肌肥厚即高血壓模型，采用膜片鉗技術并運用Pclamp(version 10.1)軟件系統記錄不同劑量的通心絡對大鼠通心絡大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)大電導鈣激活鉀通道(BKCa)的影響，以期從細胞水平和分子水平探討其擴張血管水平的作用機制。

1材料與方法

1.1動物選擇與分組將30只10周齡的雄性SD大鼠(由我院實驗動物科提供)隨機分為大劑量通心絡組(1.0 g·kg-1·d-1)、小劑量通心絡組(0.5 g·kg-1·d-1)和模型對照組，每組10只，藥物干預2個月，經腹主動脈部分縮窄術制作高血壓大鼠模型，另選10只同齡SD大鼠作為正常對照組。

1.2方法

1.2.1模型制作方法采用腹主動脈部分縮窄術制作高血壓大鼠模型：術前大鼠禁食12 h，至術前半小時給大鼠注射慶大霉素及氯霉素。運用氯胺酮行腹腔麻醉，將其置于仰臥位固定，于大鼠的腹中線位切開皮膚和肌肉。將腹主動脈及腎動脈分離后，用7號的注射針頭緊貼在距腎動脈的上方1 cm處的腹主動脈，平行放置，之后用4號的手術絲線將腹主動脈和腎動脈一起結扎，最后抽出針頭，逐層將肌肉和皮膚縫合，其中10只正常對照組只將主動脈分離但不做結扎術。術后連續注射青霉素5 d。

1.2.2給藥方法將通心絡置于蒸餾水中溶化，對高血壓大鼠進行灌胃，給予模型對照組和正常對照組大鼠相同劑量的蒸餾水灌胃，通心絡由河北石家莊以嶺藥業有限公司提供。

1.2.3血壓測量采用MRB-ⅢA型的電腦大鼠血壓及心率測定儀(由北京中日友好醫院研究所制造)，于大鼠清醒的狀態下進行無創性測定尾動脈收縮壓和心率。將尾動脈測壓儀提前預熱半小時，定標壓力信號，將實驗SD大鼠固定在固定盒內，通過加壓套將大鼠的尾部插入至尾根部，使得鼠尾恰好在脈搏傳感器的上方，之后調節鼠尾的壓迫片，使得傳染片貼住鼠尾的尾動脈，在大鼠脈搏穩定后測量血壓。

1.2.4實驗溶液的配制臺氏液(mmol/L)的配制：1 000 ml臺氏液含有NaCl 8.0 g、10%的KCl 2.0 ml(0.2 g)、10%的MgSO4·7H2O 2.6 ml(0.26 g)、5%的NaH2PO4·2H2O 1.3 ml(0.065 g)、NaHCO3(1.0 g)、 1 Mol/L CaCl21.8 ml(0.2 g)、葡萄糖 1.0 g。配制時不加CaCl2則是無鈣臺氏液。電極液(mmol/L)的配制：KCl 1.0、CaCl21.0、MgCl21.0、K-Asp 40.0以及HEPES 10.0，用KOH將pH調至7.1~7.4。臺氏液及電極液都是對稱性的高鉀液。

1.2.5大鼠主動脈VSMC的分離將游離出的大鼠主動脈中模剪成2 mm×4 mm的條塊，將其放入酶液Ⅰ(木瓜蛋白酶1，牛血清白蛋白2，二硫基蘇糖醇0.68)中，放置在恒溫水(37℃)中振蕩消化7.5 min。之后再放入酶液Ⅱ(F-型膠原酶1.615，透明質酸酶1.25)，同樣在恒溫水中振蕩消化9 min，最后用拋光了的圓頭吸管吹打8~10次血管組織，可以得到大量的平滑肌細胞，將分離好的細胞懸液滴入玻璃培養皿，4℃保存。

1.2.6膜片鉗技術選擇貼壁好、表面光滑有立體感、紋理清晰且遮光性強的梭行VSMC細胞進行實驗。將VSMC放置在顯微鏡下倒置的浴槽中，通過加樣槍加入1 ml的浴液；之后將灌有電極液的微管電極放在放大器的夾持器上，給予一定正壓于電極內，將電極尖端置于浴液中；通過高倍鏡觀察并操縱使得電極的尖端緊貼于細胞表面，觀察到應答電流降低后施加負壓，直至應答電流減小至零；高阻封接形成后，運用電極操縱器將微電極迅速提起，將其于空氣中暴露3 s后再次置于浴槽中，如此時應答電流以及阻抗和以前相比均沒發生變化，則形成了內面向外式的膜片。實驗所得的數據通過Pclamp(version 10.1)軟件進行處理分析，經Clampfit分析程序自動測量各組大鼠VSMC的BKCa的開放概率(Po)、電流幅度值(Amp)、平均開放時間(To)和平均關閉時間(Tc)。

2結果

2.1各組血壓比較通心絡組和模型對照組的SD大鼠的血壓水平〔(157±9)mmHg,(165±4)mmHg〕顯著高于正常對照組〔(102±7)mmHg〕(P<0.05)。

2.2兩組BKCa的鈣敏感性比較在內面外向式的膜片下，不同Ca2+濃度0、10-8、10-7、10-6mol/L下的正常對照組和模型對照組的BKCa通道活性均明顯增強，呈顯著的濃度依賴性；Po以及To均隨浴液Ca2+濃度的增加而增加，Tc隨著浴液Ca2+濃度的增加而縮短，浴液Ca2+濃度對BKCa通道的Amp影響不大，與正常對照組相比，模型對照組通道活性的改變更顯著(P<0.05)。見表1。

2.3通心絡對BKCa通道的影響保持浴液游離的Ca2+濃度為10-7mol/L，鉗制電壓固定在+40 mV時，內面外向式的膜片下，模型對照組的Po水平顯著高于正常對照組，Tc顯著低于正常對照組；大、小劑量的通心絡組的Po及To的水平均顯著高于模型對照組，Tc顯著低于模型對照組；大劑量通心絡組的Po及To的水平比與小劑量通心絡組更高，Tc的水平更低(均P<0.05)。見表2。

表1　兩組在不同的Ca 2+濃度下BKCa活性相關指標的比較

與正常對照組同濃度比較：1)P<0.05；與同組Ca2+濃度為0 mol/L比較：2)P<0.05

表2　不同組BKCa活性相關指標的比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型對照組比較：2)P<0.05；與小劑量通心絡組比較：3)P<0.05

3討論

血管平滑肌的張力調節主要受神經調節、肌源性調節和體液調節等因素影響。受到牽張刺激時，血管平滑肌可使得VSMC去極化，產生微血管收縮，而當牽張刺激減弱或血壓降低時，管壁將自動舒張〔2〕。BKCa在VSMC中廣泛存在，是血管平滑肌上主要的一種外向電流通道，能起到調節血管的舒縮作用，尤其在血管的肌源性調節過程起著重要作用〔3〕。當VSMC因各種原因引起去極化時，將激活細胞膜上電壓依賴性的鈣通道，導致細胞內的鈣濃度急劇上升，從而Ca2+-鈣調蛋白-肌球蛋白輕鏈激酶途徑被激活，引起VSMC收縮，從而血管的緊張性被增強。隨著細胞內的Ca2+上升，BKCa又被激活，內質網上的鈣泵敏感性通道得以開放，鉀離子外流，使得電壓依賴性的Ca2+內流停止或減少，胞內的鈣濃度降低，細胞膜趨向超計劃，最后，血管平滑肌得到舒張，以此對抗去極化造成的血管收縮〔4〕。由此BKCa的負反饋作用起到了調控VSMC去極化及血管收縮程度，維持機體在靜息狀態下的血管張力的作用。本次實驗結果與有關報道一致〔5〕。

血管功能性的收縮加強是高血壓的發病因素之一，高血壓時VSMC的過度增殖將引起阻力血管肥厚和管腔狹窄，使得機體對體內的收縮血管活性物的反應增強，而對舒張血管活性物的反應下降，造成更嚴重的管腔狹窄，加劇了血壓的升高，產生高血壓的“惡性循環”〔6〕。而BKCa功能以及量的變化又在血管功能性發揮上占有重要作用，因此，有效地干預和治療手段，尋求一種新的BKCa激動劑能夠有效降低心血管事件的發生，從而延長人類壽命。以往的研究〔7〕表明，通心絡能夠有效減輕心肌梗死后心肌間質的膠原纖維沉積；心絞痛病人經通心絡治療后，其von Willebrand水平能顯著降低，纖維結合蛋白的水平明顯回落，證明通心絡能起到保護血管內皮細胞功能的效果〔8〕；通心絡可以顯著降低高血壓大鼠的血清內皮素水平，使大鼠NO的濃度增加，從而改善血管內皮功能〔9〕；通心絡一方面能在某種程度上阻止高血壓大鼠的血壓上升，同時能抑制高血壓大鼠的阻力血管肥厚〔10〕。本研究結果與上述已有研究結論一致。結果表明通心絡能夠在不降低血壓的情況下改善高血壓患者的血管重塑，這可能是由于通心絡將BKCa激活后，VSMC的鉀離子外流，引起細胞膜的超極化，降低Ca2+內流以及細胞內的Ca2+釋放，抑制電壓依賴性的鈣通道，使得阻力血管的非內皮依賴性舒張功能得到改善。

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〔2014-09-27修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)