基于分子及傳統方法對九龍山自然保護區黑麂資源研究

季國華，鄭偉成*，王 華，劉菊蓮，潘成椿，葉飛英

（1. 浙江九龍山國家級自然保護區管理局，浙江 遂昌 323300；2. 浙江師范大學 生態研究所，浙江 金華 321004）

基于分子及傳統方法對九龍山自然保護區黑麂資源研究

季國華1，鄭偉成1*，王 華2，劉菊蓮1，潘成椿1，葉飛英1

（1. 浙江九龍山國家級自然保護區管理局，浙江 遂昌 323300；2. 浙江師范大學 生態研究所，浙江 金華 321004）

2012年10月和2013年5月，采用分層—樣地—樣帶抽樣統計法分別對九龍山自然保護區的核心區、緩沖區和實驗區所設置的15條樣帶進行黑麂（Muntiacus crinifrons）資源調查，結合樣帶法、紅外相機技術法以及分子標記法對九龍山保護區黑麂的種群密度及保護現狀進行了調查。結果表明：保護區內的黑麂種群平均密度為7.93 ±0.75只/km2，其中核心區、緩沖區、實驗區黑麂種群密度分別為10.27±1.17、7.58±0.26、4.89±1.28只/km2；通過方差分析，不同樣地間黑麂種群密度差異極顯著（F = 10.45 > F3,26= 4.64，P < 0.01）。這表時，黑麂在九龍山保護區內廣泛分布，而主要集中分布在上寮坑、巖坪一帶，黃基坪等周邊地帶為黑麂的次要分布區，其余地區為一般分布區。

黑麂種群密度；樣帶法；紅外相機法；分子標記法

黑麂（Muntiacus crinifrons），也稱紅頭麂、烏金麂、紅頭青麂、蓬頭麂、烏獐，為典型的亞熱帶山地森林動物，國家一級保護動物，隸屬偶蹄目（Artiodactyla）鹿科（Cervidae）麂屬（Muntiacus），在瀕危野生動植物物種國際貿易公約（CIES）和國際自然與自然資源保護聯盟（IUCN）名錄中分別被列入附錄Ⅰ和易危（Vulnerable，VU）級[1]。現存種群主要分布于浙江、安徽、江西和福建四省[2～3]。

在野外很難見到活的黑麂個體和獲得黑麂的肌肉組織進行分子水平的分析，但可以通過非損傷性取樣（noninvasive sampling）[4]，獲得黑麂的糞便[5]、毛發[6]等進行相關研究。程宏毅等[7～10]成功從黑麂的糞便中提取出DNA及其PCR檢測，為從分子水平研究黑麂提供了技術基礎。周襄武等[11～12]從黑麂的糞便中提取DNA，并擴增線粒體DNA細胞色素b基因和 2個微衛星位點進行檢測，同時提取黑麂肌肉和皮毛樣品的DNA作對照，結果表明，該方法可以從糞便中提取高質量的黑麂DNA，并可進行有效擴增。劉軍[13]通過對黑麂糞便的研究，對黑麂進行個體識別和性別鑒定。因此，以黑麂糞便作為樣本對黑麂的數量進行研究是可行的。

紅外線觸發自動數碼相機陷阱技術（infrared triggered cameras technology，ITCT），以下簡稱紅外相機技術，是一項定性和定量相結合的調查技術，具有晝夜連續工作、調查成本低、無創傷、環境干擾小、抗環境變化以及能獲得高度隱蔽物種和地形復雜區域的信息等優點[14～15]。對于保護區來說，監測是為了掌握資源和生物多樣性變化的趨勢，并且監測需要獲得長時間可比較的數據。

黑麂在九龍山的分布呈現出分布廣，數量多，種群密度高的特點，九龍山保護區及周邊區域已經成為我國黑麂最重要的分布中心和最大黑麂種群的集中分布區。本次調查九龍山保護區黑麂的資源，有利于掌握近10 a來黑麂種群數量的變化，以評估對黑麂保護的成效，也為今后保護對策和措施的制定和實施提供科學依據。

1 研究區自然概括

九龍山國家級自然保護區位于浙江省遂昌縣西南部，地處浙、閩、贛三省交界處（118° 49′ ～ 118° 55′ E，28° 19′ ～ 28° 24′ N），為武夷山系仙霞嶺山脈的一個主要分支，是錢塘江水系的最南端源頭[1]。九龍山山地陡峭，高峰群集。保護區內山體坡度 > 40°的面積約占總面積的80%。九龍山自然保護區屬中亞熱帶濕潤季風區，一年中氣候有明顯的季節性變化，氣候呈現明顯的垂直地帶性。降水量大，平均年降水量在1 500 ～ 2 000 mm，主要集中在4-6月，占全年降水的46%，7-8月為少雨期[16]。植被類型主要分為針葉林、針闊混交林、闊葉林、竹林和灌叢[17]。保護區優良的森林生態環境，為野生動物的棲息、繁衍提供了良好的條件。九龍山保護區是國家一級保護動物、中國特有的世界性受脅物種黑麂最重要的分布中心和最大野生種群的集中分布區。

2 調查方法

通過廣泛收集和查閱以往有關黑麂的文獻作為基礎資料，于2011年11月至2013年8月，在九龍山國家級自然保護區開展黑麂資源的調查。

2.1 樣帶（樣方）法

2012年10月和2013年5月，采用國內外常用的分層—樣地—樣帶抽樣統計法[18]，分別對九龍山自然保護區的核心區、緩沖區和實驗區所設置的15條樣帶進行調查。樣帶設置以保護區內4個保護站為樣地，遵守隨機等概率原則，向外呈輻射狀進行布置，與2002年至2003年調查所設的樣帶一致[1]以便對比分析。黃壇淤2條代表實驗區（樣帶長度為（3 000、3500 m）；黃基坪4 條代表緩沖區（3 000、3 500、3 500、4 000 m），上寮坑5條（3 000、3 500、4 000、5 000、5 000 m）、巖坪4條（3 500、4 000、4 000、5 000 m）代表核心區，樣帶單側寬度為20 m。

調查樣帶兩側各20 m范圍內及樣方內的黑麂活動的新鮮痕跡（如足跡、臥跡、洞穴、糞便、食物殘跡、叫聲等），記錄生境類型，用GPS進行定位。2.2 紅外相機法

于2011年11月至2013年8月，在九龍山國家自然保護區的不同區域布置了32臺紅外相機進行監測。在相機的布置過程中主要采取隨機型和海拔垂直型放置模式，部分區域采取十字型模式[19]（表1）。

表1 九龍山紅外相機擺放模式Table 1 Camera trap placement patterns in Jiulongshan Nature Reserve

紅外相機在各個區域內均沿所設定的樣地進行擺置，紅外相機均放置在樣地內，相鄰紅外相機的距離保持在500 m左右。樣地大小的設定原則是同一樣地內紅外相機間距離最大的設為樣地的長，確定樣地長度后，以橫向相機間最大距離為樣地寬度。紅外相機在樣地內的放置沿黑麂常出沒的路線及足跡鏈豐富的生境放置。所放置紅外相機樣地的大小在不同區域布置相機時用GPS儀表同時記錄每臺相機所在位置的海拔、坡度、坡向、經緯度等生態因子。

2.3 DNA指紋技術

2.3.1 實驗材料 除了在樣帶（樣方）法調查過程中收集黑麂糞便外，在內北坪、黃基坪和黃壇塢分別設置樣方（表2），2012年10月和2013年5月各收集1次。收集時，仔細搜尋樣方內的黑麂新鮮糞便，當發現黑麂新鮮糞便時，采集部分糞便，現場裝入盛有無水乙醇的帶蓋密封塑料瓶中，帶回實驗室便將其放入-20℃冰箱中保存；采集時均使用一次性手套或者滅菌容器和材料以防止采樣過程中的人為污染和樣品間的交叉污染，并及時標注、記錄樣品的采集時間、采集地名、海拔高度和經緯度，以及采集者姓名等詳細資料。

2.3.2 實驗處理 將從九龍山保護區內采集的黑麂糞便樣本帶回實驗室，放入冰箱中-20℃保存備用。將采集的糞便樣本進行糞便DNA提取，然后進行PCR擴增，將PCR產物送上海生工進行檢測，獲得數據后用相關軟件進行分析。糞便DNA的提取及PCR用劉軍[21]的方法。

表2 各樣地黑麂糞便的采集Table 2 Feces collected in sample plots

2.4 數據處理

2.4.1 樣帶（樣方）法 依據前期發現黑麂實體與活動痕跡的關系，確定出黑麂活動痕跡（足跡、糞便和拱痕等）與個體數之間的關系，即黑麂足跡鏈和拱痕間隔500m以上的按2個個體計算，500m以內的按1個個體計算，依次類推，累加黑麂的密度得到總的密度。

樣帶（樣方）內種群密度計算公式[20]：

式中，i代表各樣帶（樣方），j代表各生境，Di為i樣帶（樣方）中黑麂的密度（只/km2），Nij為i樣帶（樣方）中第j種生境累計單位時間內黑麂痕跡總數，Aij為樣帶（樣方）中第i種生境的調查面積（km2），t為單位時間（7 d），以足跡為指標時，根據足跡大小排除重復ε為1；以糞便為指標時，需要用排便率對數據進行修正，ε即為日排便率（堆/d）。區間估計[22]為

求得九龍山保護區內的黑麂種群密度后，密度乘以黑麂的棲息環境面積即為黑麂的種群數量。

2.4.2 紅外相機數據處理 在對2012年10月至2013年5月的相片整理后，得到黑麂的獨立相片（independent photograph，IP）共468張。對地點或時間相近連續拍攝的物種照片采用相同側面、部位的斑紋、體型、毛色等特征進行比對，以判斷是否屬同一次數，不同次數的照片定義為獨立照片。識別在ACD see 15軟件的輔助下進行。

紅外相機黑麂的日拍攝頻率計算公式：

其中：IP為獨立相片數（張），IPij為樣地i中j相機的獨立相片數（張）；T為紅外相機2012年10月放置至2013年5月紅外相機數據收回經歷的時間，每月按30 d進行計算。

2.4.3 DNA指紋技術數據處理 根據所采集糞便的面積計算出黑麂的種群密度，然后算出整個保護區內的黑麂種群數量。用軟件Cervus3.0[22]分析微衛星數據，對糞便樣本進行個體識別，確定黑麂的個數。基于非損傷性標志重捕法統計種群數量，根據個體識別的數據，即不同地點的同一個體數據，其中任何一次可記為標志，其他記錄可看作該個體的重捕。數量分析使用軟件Capwire[24～25]完成。軟件有兩種模型：ECM（even capture probability model）和TIRM（two innate rates model）。ECM模型的基本假設是種群中每個個體的排便率基本一致，對每個個體的抽樣強度也基本一致，因此每個個體被捕獲的概率一致，即種群數量N的倒數 1/N。TIRM模型的基本假設是種群中個體間被捕獲的概率相差很大，在模型擬合時按照捕捉的概率將個體分成捕捉困難（B）和容易捕捉

（A）兩大類。

3 結果與分析

3.1 樣帶（樣方）法調查結果與分析

3.1.1 不同功能區黑麂種群密度 通過調查統計，其結果見表 3。不同樣地的黑麂種群密度變化較大，反應出黑麂的分布是不均勻的。其中上寮坑樣地密度最高，為10.70±1.58只/km2；黃壇淤樣地密度最小，為4.89±1.28 只/km2；黃基坪和巖坪樣地密度居中，分別為7.58±0.26只/km2、9.83±0.76只/km2，全區密度平均為8.48±0.75 只/km2。

表3 各樣地黑麂的種群密度Table 3 Population density of M. crinifrons in investigated sample plots

本次調查區域涵蓋九龍山保護區內的核心區、緩沖區和實驗區。其中上寮坑和巖坪為核心區；黃基坪為緩沖區；黃壇淤為實驗區。由于核心區、緩沖區和實驗區的棲息地生境狀況、人為干擾程度以及保護力度等存在差別，黑麂在各區的分布并不是均勻的。核心區、緩沖區、實驗區黑麂種群密度分別為10.27±1.17、7.58±0.26、4.89±1.28只/km2。

有關研究表明，生境質量對鹿科動物種群密度的波動起著重要的作用[25-27]。從以上結果可以看出，黑麂更喜歡選擇在棲息地質量優越的核心區地帶活動，在緩沖區內黑麂種群密度也維持在比較高的水平，而在實驗區則較少。除了黑麂喜歡棲息于高海拔外，各功能區的生境差異是導致黑麂在九龍山保護區內分布不均勻的主要因素。

3.1.2 不同樣地間黑麂種群密度的差異 計算4個樣地中黑麂種群密度及方差，并檢驗不同樣地間種群密度的差異。通過方差分析，不同樣地間黑麂種群密度差異極顯著（F = 10.45 > F3,26= 4.64，P < 0.01），種群密度最低的黃壇淤樣地（4.89±1.28）與處于核心區內的上寮坑和巖坪樣地均存在極顯著差異（P < 0.01），與黃基坪樣地存在顯著差異（P < 0.05）。上寮坑、黃基坪、巖坪三個樣地間的種群密度存在顯著差異（F = 5.07 > F2,21= 3.47，0.01 < P < 0.05），上寮坑、巖坪樣地的密度高于黃基坪樣地。從以上結果可以看出，黑麂在九龍山保護區內廣泛分布，而主要集中分布在上寮坑、巖坪一帶，黃基坪等周邊地帶為黑麂的次要分布區，其余地區為一般分布區。

本次調查結果與2002年至2003年的調查結果[1]相比，各樣地黑麂種群密度均有增加，黃壇淤、上寮坑、巖坪和黃基坪4個樣地分別增加了1.68、1.96、1.75和1.33只/km2，全區黑麂密度為8.48±0.75只/km2，全區面積為55.25 km2，黑麂數量為469±41只，資源量有所增加。

3.2 紅外相機調查結果與分析

對紅外相機所獲得的數據進行整理分析，結果見表4。全區域黑麂的日拍攝率為2.08次/d，其中核心區黑麂的日拍攝率最高，為1.68次/d，其中七樹坑樣地日拍攝率居核心區首位，達0.69 次/d；緩沖區的黃基坪日拍攝率最低，為0.10次/d；實驗區為0.3次/d。通過不同區域的日拍攝率，可以大致看出核心區的黑麂密度比緩沖區及實驗區明顯要高。但此次發現作為緩沖區的黃基坪日拍攝率反而比實驗區的黃壇塢要低。原因可能是因黃基坪所設置樣地小，相機布置量少造成的。紅外相機的日拍攝率能大致對不同區域黑麂密度進行對比，但由于受到樣地選擇，相機擺放方式等因素影響，只能作為密度大小判斷的一個依據，具體黑麂密度應結合樣地法和DNA指紋技術進行調查計算。

表4 九龍山國家自然保護區不同區域紅外相機捕捉的黑麂日拍攝頻率Table 4 Capture rate of M. crinifrons in different sample plots

3.3 DNA指紋技術調查結果與分析

DNA指紋技術調查結果見表5，得出的內北坪、黃基坪和黃壇塢樣地的平均密度分別代表核心區、緩沖區和實驗區的密度，全區黑麂資源量為492只。

表5 DNA 指紋技術調查的黑麂數量Table 5 Numbers of M. crinifrons obtained by DNA

樣帶（樣線）法估算出黑麂資源量為469±41只，DNA指紋技術法結果顯示保護區內的黑麂資源量為492只。綜合以上黑麂數量的調查方法，九龍山自然保護區內的黑麂資源為420～520只。

4 黑麂的資源評價與保護

1999-2000年，浙江省黑麂專項調查顯示，浙江省黑麂資源總量為3 500 ～ 4 000只[3]；2002-2003年，鄭祥等[1]對九龍山保護區內黑麂資源調查，全區黑麂種群平均密度為7.32±0.69只/km2，為404±38只；2012-2013年，對黑麂資源調查顯示，九龍山保護區內的黑麂種群平均密度為7.93±0.75只/km2，數量為420 ～ 520只。本次調查結果與以往相比，九龍山保護區內黑麂的數量在增加，說明九龍山棲息環境利于黑麂的生存和繁殖，九龍山保護區對黑麂的保護工作是卓有成效的。

為了更好地發揮自然保護區的作用，對九龍山黑麂資源的保護提出以下建議：

（1）開展常規化的黑麂種群數量動態監測。建議每5 a復查一次，有利于掌握黑麂種群數量的變化規律，以制定和調整相應的保護對策和措施。

（2）加強對保護區黑麂棲息環境質量的監測。主要包括黑麂的食物（種類、可利用量、質量）、隱蔽所（類型、數量和質量）等變化特征，以確定保護區內黑麂的環境容納量。

（3）加強對保護區的管理和對黑麂保護的宣傳。保護區在開展保護、監測、減災等工作的同時，可以采用標語、警示牌、制作和播放黑麂宣傳保護視頻等多種形式，加強對周邊地區居民及過往人員的宣傳教育，使其能主動參與黑麂的保護工作。如果發現受傷的黑麂，要及時進行救護。加強與當地政府的協調和合作，對保護區外圍的山林采取相應的保護措施，以擴大黑麂的生存空間。

（4）開展黑麂的人工養殖。在自然保護區的實驗區，可以考慮建立以黑麂為主的珍稀動物養殖場。既可以收養沒收、誤傷、誤捕的珍稀野生動物，又可以開展黑麂等珍稀動物的生物學研究，馴養和繁殖人工種群，為珍稀動物的就地保護和異地保護以及資源利用開拓新的途徑。

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Investigation on Distribution of Muntiacus crinifrons in Jiulongshan National Nature Reserve

JI Guo-hua1，ZHENG Wei-cheng1*，WANG Hua1，LIU Ju-lian1，PAN Cheng-chun1，YE Fei-ying1
(1. Jiulongshan National Nature Reserve Administration of Zhejiang, Suichang 323300, China; 2. School of Ecology, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China)

Investigations on Muntiacus crinifrons resources were conducted from October 2012 to May 2013, by stratified sampling method at 15 transects in the core zone, buffer zone, and experimental zone of Jiulongshan National Nature Reserve of Zhejiang, combined with infrared triggered cameras technology(ITCT) and molecular makers. The result showed that the average density of M. crinifrons was 7.93±0.75/km2in the Jiulongshan, 10.27±1.17/km2in core zone, 7.58±0.26/km2in buffer zone and 4.89±1.28/km2in experimental zone. Analysis of variance demonstrated that there was significant difference among sample plots （F =1 0.45 > F3,26= 4.64，P < 0.01）. The investigation resulted that M. crinifrons distributed widely in Jiulongshan National Nature Reserve.

Muntiacus crinifrons; population density; transect method; infrared triggered camera technology; molecular marker

S718.6

A

1001-3776（2015）04-0001-06

2014-10-12；

：2015-03-20

林業國家級自然保護區中央財政補助資金（浙財農字〔2010〕174號）

季國華（1978-），男，浙江遂昌人，助理工程師，從事自然資源保護工作；*通訊作者。