重組IL-12逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞體外對鼻咽癌細(xì)胞的殺傷作用

重組IL-12逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞體外對鼻咽癌細(xì)胞的殺傷作用

朱欠元曾常愛肖帆李寶金1

(井岡山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻喉科，江西吉安343000)

摘要〔〕目的體外實驗評估重組白細(xì)胞介素(IL)-12逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞對鼻咽癌細(xì)胞的殺傷作用。方法構(gòu)建重組IL-12重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，體外轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞(DC)，經(jīng)培養(yǎng)后收集上清液，檢測IL-12、干擾素-γ(IFN)的分泌水平。以鼻咽癌細(xì)胞CNE-2為靶細(xì)胞，進行細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)細(xì)胞毒活性測定。結(jié)果成功構(gòu)建含有mIL-12的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒；IL-12基因修飾DC可以顯著誘導(dǎo)的大量IL-12和IFN-γ分泌，與未轉(zhuǎn)染DC組比較，差異有顯著意義(P<0.01)；DC-IL-12誘導(dǎo)的CTL及其上清液對鼻咽癌細(xì)胞CNE-2均有顯著殺傷作用，與未轉(zhuǎn)染DC組相比較差別有顯著(P<0.01)。結(jié)論IL-12基因修飾樹突細(xì)胞可顯著誘導(dǎo)大量IFN-γ分泌并增強其誘導(dǎo)特異性CTL對腫瘤的殺傷效能。

關(guān)鍵詞〔〕IL-12基因；樹突細(xì)胞；鼻咽癌

中圖分類號〔〕R739.63〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81350022)

通訊作者：曾常愛(1962-)，男，副教授，主要從事頜面外科的研究。

1廣州市第八人民醫(yī)院普通外科

第一作者：朱欠元(1967-)，男，教授，主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉疾病的研究。

Killing effect of IL-12 recombinant retrovirus transfected dendritic cells in nasopharyngeal carcinoma cells

ZHU Qian-Yuan,ZENG Chang-Ai,XIAO Fan,etal.

Department of Otorhinolaryngology,Clinic Medical College,Jinggangshan University,Ji'an 343000，Jiangxi,China

Abstract【】ObjectiveIn vitro cytotoxicity evaluation of recombinant IL-12 retrovirus transfected dendritic cells in nasopharyngeal carcinoma cells.MethodsRecombinant IL-12 in vitro recombinant retroviral vector was constructed,dendritic cells(DC) were transfected,the culture supernatant was collected,the secretion level of ELISA in supernatant was detected by IL-12,IFN-γ. In nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells,cytotoxic T lymphocyte(CTL) was tested.ResultsThe construction of mIL-containing 12 recombinant retrovirus was succeeded;IL-12 gene modified DC significantly induced IL-12 and IFN-γ secretion(P<0.01). CTL and its supernatant had significant killing effect,compared with that of non transfected DC group(P<0.01).ConclusionsIL-12 gene modified DC could significantly induce IFN-γ secretion and enhance the killing effectiveness of the induction of specific CTL on tumor.

【Key words】IL-12 gene;Dendritic cell;Nasopharyngeal carcinoma

近年來，腫瘤基因治療成為研究熱點。白細(xì)胞介素(IL)-12是腫瘤基因治療細(xì)胞因子之一，已用于多種腫瘤的臨床試驗治療〔1～4〕，在抗腫瘤基因治療中有一定的應(yīng)用價值。本研究探討體外構(gòu)建IL-12重組逆轉(zhuǎn)錄病毒對鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的殺傷作用，為進一步開展靶向鼻咽癌基因療法奠定實驗基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料RPMI1640，Lipofectamine，胎牛血清，聚凝胺購自Gibco公司；G418購自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶及小鼠IL-12p70購自TaKaRa公司；ELISA檢測試劑盒購于晶美公司；細(xì)胞毒性分析試劑盒購于Promega公司；mIL-12基因真核表達載體、DH5α大腸桿菌和人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2由中山大學(xué)分子醫(yī)學(xué)中心提供；PA317細(xì)胞、NIH3T3成纖維細(xì)胞、人外周血的樹突細(xì)胞和淋巴細(xì)胞由廣州市第八人民醫(yī)院李寶金博士提供。

1.2方法

1.2.1IL-12基因的擴增和鑒定將含IL-12基因轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌進行擴增，堿裂解法提取菌液中質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒鑒定保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Lipofectamine脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染選擇生長良好的PA317，用胰蛋白酶消化后接種在6孔板內(nèi)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。采用Lipofectamine脂質(zhì)體介導(dǎo)法將質(zhì)粒IL-12轉(zhuǎn)染包裝，通過含G418的細(xì)胞培養(yǎng)液進行篩選，3 w后抗性克隆形成移至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3重組逆轉(zhuǎn)錄病毒液的制備及病毒滴度測定用不含G418的培養(yǎng)液置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)上述抗G418的克隆細(xì)胞株，反復(fù)培養(yǎng)收集各代病毒液進行濃縮與保存，NIH3T3法測定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度。

1.2.4樹突細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染致敏鼻咽癌患者外周血中收集單個核細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度6孔板上進行貼壁，去除懸浮的淋巴細(xì)胞，留下樹突細(xì)胞并加入含IL-4(20 ng/ml)、GM-CSF(100 ng/ml)、和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。PA317-IL-12進行轉(zhuǎn)染，48 h收集培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測上清液中IL-12、干擾素(IFN)-γ的分泌量。

1.2.5細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)細(xì)胞毒活性測定按試劑盒有關(guān)說明，以經(jīng)IL-12轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞培養(yǎng)上清液為殺傷因子，靶細(xì)胞為鼻咽癌細(xì)胞CNE-2，進行細(xì)胞毒實驗。對照組為未轉(zhuǎn)染IL-12基因的DC組。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS10.0軟件，多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗。

2結(jié)果

2.1IL-12質(zhì)粒擴增、鑒定IL-12質(zhì)粒被NotⅠ酶切出約11 kb的線性DNA，NotⅠ+XhoⅠ切出包含p35和p40的2.4 kb小片段，以BamHⅠ+EcoRⅠ切出四個片段(圖1)。酶切鑒定結(jié)果均與所提供的資料相符。

M：λDNA/Eco911；1：IL-12；2：Bgl Ⅱ;3：XhoⅠ;4：BamHⅠ+EcoRⅠ;5：BamHⅠ+Hind Ⅲ;6：NotⅠ+XhoⅠ 圖1　IL-12酶切鑒定結(jié)果

2.2活性檢測樹突細(xì)胞經(jīng)IL-12基因修飾后，48 h分泌高水

平IL-12〔(23.65±4.51)pg/L〕及IFN-γ〔(726.22±28.23)pg/ml〕，與未轉(zhuǎn)染DC組〔(7.42±2.75)pg/L,(79.46±2.98)pg/L〕比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，DC-IL-12誘導(dǎo)的CTL及其上清液對鼻咽癌細(xì)胞CNE-2細(xì)胞均有顯著殺傷作用，分別為(82.43±8.7)%和(57.4±4.3)%，與未轉(zhuǎn)染DC組〔(76.45±8.5)%,(18.23±5.3)%〕比較有顯著性差異(P<0.01)。

3討論

IL-12作為細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子對腫瘤有直接對抗作用，在原發(fā)性、繼發(fā)性腫瘤的免疫反應(yīng)中均起重要作用〔5，6〕。IL-12結(jié)構(gòu)獨特，由異二聚體構(gòu)成，須借助二硫鍵將p35、p40兩個亞基共價結(jié)合為75 kD糖蛋白鏈發(fā)揮作用。傳統(tǒng)獲取IL-12活性鏈方法是將編碼p35、p40的基因共同轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，但難以控制p35、p40的等量表達，常常有p40高表達，因而降低IL-12的整體生物學(xué)活性〔7〕。本研究通過單連IL-12表達質(zhì)粒，連接p35、p40多順反子序列IRES以確保兩個亞基同時轉(zhuǎn)錄，更有利于IL-12肽鏈具有生物活性。樹突細(xì)胞是體內(nèi)功能強大的抗原呈遞細(xì)胞，IL-12主要來源于樹突細(xì)胞的分泌。本研究采用基因轉(zhuǎn)染使鼻咽癌患者外周血來源的樹突細(xì)胞獲得可表達IL-12的基因，使樹突細(xì)胞能在呈遞腫瘤抗原的同時高水平地分泌IL-12及IFN-γ。結(jié)果表明，IL-12基因修飾DC可以顯著增強其誘導(dǎo)同源T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗鼻咽癌免疫的能力，為鼻咽癌的基因靶向治療奠定基礎(chǔ)。

4參考文獻

1Marchi LH，Paschoalin T，Travassos LR，etal.Gene therapy with interleukin-10 receptor and interleukin-12 induces a protective interferon-γ-dependent response against B16F10-Nex2 melanoma〔J〕.Cancer Gene Ther，2011；18(2)：110-22.

2He XZ，Wang L，Zhang YY.An effective vaccine against colon cancer in mice：use of recombinant adenovirus interleukin-12 transduced dendritic cells〔J〕.World J Gastroenterol，2008；14(4)：532-40.

3Guida M，Casamassina A，Monticelli G，etal.Basal cytokinesprofile in metastatic renal cell carcinoma patients treated with sub-cutaneous IL-2-based therapy compared with that of healthy donors〔J〕.J Transl Med，2007;5(1)：51.

4Kayashina H，Toshina T，Okano S，etal.lntratumioral neoadjuvant inmunotherapy using IL-12 and dendritic cells is an effectivestrategy to control recurrence of murine hepatocellular careinoma in immunosuppressed mice〔J〕.J Immunol，2010；185(1)：698-708.

5Engel MA，Neurath MF.Anticancer properties of the IL-12 family-focus on colorectal cancer〔J〕.Curr Med Chem，2010；17(29)：3303-8.

6Vecchio MD，Bajetta E，Canova S，etal.Interleukin-12：Biological properties and clinical application〔J〕.Clin Cancer Res，2007；13(16)：4677-985.

7Schoenhaut DS，Chua AO，Wolitaky AG，etal.Cloning and expression of murine IL-12〔J〕.J Immunol,1992；148(11)：3433-40.

〔2014-08-11修回〕

(編輯李相軍)