紅芪多糖對(duì)早期糖尿病腎病db/db小鼠腎臟保護(hù)作用及PKC/TIMP-1表達(dá)的影響

紅芪多糖對(duì)早期糖尿病腎病db/db小鼠腎臟保護(hù)作用及PKC/TIMP-1表達(dá)的影響

祁雪艷金智生陳長浩關(guān)雁王倩余海艷張梅菊

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000)

摘要〔〕目的通過研究紅芪多糖(HPS)對(duì)糖尿病腎病(DN)db/db小鼠腎組織中PKC與金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1表達(dá)的影響，探討HPS對(duì)DN小鼠腎臟的保護(hù)機(jī)制。方法將50只5周齡的雄性db/db小鼠隨機(jī)分為5組:HPS高、中和低劑量組，替米沙坦陽性對(duì)照組，模型對(duì)照組；另設(shè)正常組，為10只同周齡的db/m小鼠。給藥8 w，于給藥前及給藥后第2、4、6、8周末檢測(cè)小鼠血糖濃度，第8周末收集小鼠24 h尿，檢測(cè)24 h尿蛋白排泄量后處死小鼠，眼球取血并分離血清檢測(cè)甘油三酯(TC)、總膽固醇(TG)等，并采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、免疫蛋白印跡檢測(cè)腎組織PKC蛋白及IIMP-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果HPS治療8 w后，db/db小鼠的血糖、體重均較模型組降低，但只有高、中劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且中劑量組下降明顯(P<0.01)；24 h蛋白尿排泄量與模型組相比均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較各治療組TC、TG均降低(P<0.05)，其中中劑量組下降更明顯(P<0.01)。與模型組比較，TIMP-1 mRNA的表達(dá)量除HPS低劑量組無改變外，其余治療組均增強(qiáng)(P<0.05)，且HPS中劑量組變化明顯(P<0.01)；PKC蛋白的表達(dá)在HPS高、中劑量組有所下降(P<0.05)，且HPS中劑量組下降明顯(P<0.01)。結(jié)論HPS可能通過抑制腎小球系膜細(xì)胞上PKC蛋白的表達(dá)及增強(qiáng)TIMP-1mRNA的表達(dá)，減緩糖尿病腎病的病程進(jìn)展。

關(guān)鍵詞〔〕紅芪多糖;糖尿病腎病;蛋白激酶C(PKC);金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1;db/db小鼠

中圖分類號(hào)〔〕R587〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)

通訊作者：金智生(1963-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治研究。

第一作者：祁雪艷(1988-)，女，在讀碩士，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治研究。

Protection effect of Hedysarum polybotrys polysacchcaide on early diabetic nephropathy db/db mice and its influence on expression PKC/ TIMP-1 in renal tissue

QI Xue-Yan，JIN Zhi-Sheng,CHEN Chang-Hao,etal.

Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China

Abstract【】ObjectiveTo study the influence of HPS on diabetic nephropathy(DN) db/db mice of activating the PKC and TIMP-1.Methods50 db/db male mice(5 weeks old) were randomly divided into HPS(low-dose,mid-dose,hing-dose groups),enalaprilat,model groups;10 db/m mice(5 weeks old) were employed as normal group. The level of blood glucose was measured at before and after intervention 2,4,6,8 weekends. The levels of blood urea nitrogen(BUN),serum creatinine(Scr),and 24 h urine protein were measured after 8 w,and the changes of mRNA and protein expressions of renal tissue PKC and TIMP-1 were detected by RT-PCR and Western blot.ResultsAfter interventing 8 w,compared with those of model group,the levels of blood glucose,body weight were decreased,but only the high,middle dose groups was statistically difference(P<0.05),especially middle dose group was decreased significantly(P<0.01);24 h urine protein,the expressions of P38MAPK and P38MAPK,MMPs mRNA and the corresponding protein were all decreased(P<0.05),except HPS low-dose group and enalaprilat group(P>0.05),and in mid-dose group of HPS they were improved more significantly(P<0.01).ConclusionsHPS could delay the development of DN by inhibiting the P38MAPK,MMPs protein and mRNA expressions in the glomerular mesangial cell membrane.

【Key words】HPS;Diabetic nephropathy;PKC/TIMP-1;db/db mice

蛋白激酶C(PKC)是一組由多種亞型組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族〔1〕。近年來文獻(xiàn)表明，糖基化終產(chǎn)物的產(chǎn)生、多元醇代謝通路的激活以及PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活均可導(dǎo)致糖代謝紊亂，與糖尿病腎病(DN)發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系〔2〕。高糖條件下，系膜細(xì)胞內(nèi)正常的葡萄糖三羧酸循環(huán)被打破，多元醇等多條通路激活，導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)和PKC水平升高〔3〕。金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成與降解中起到重要作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)DN的治療主要是控制血壓、血脂、血糖等以及使用腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)阻斷劑，但仍然會(huì)有很大一部分患者進(jìn)入終末期腎病(ESRD)階段。本實(shí)驗(yàn)主要探討紅芪多糖(HPS)對(duì)DN小鼠腎臟保護(hù)作用及PKC與TIMPs表達(dá)的影響，以此了解其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器SPF級(jí)肥胖2型糖尿病動(dòng)物模型db/db小鼠(BKS.Cg-m+/+LeprdbNJU)，5周齡，雄性，50只，體重(35±2)g；SPF級(jí)db/m小鼠，5周齡，雄性，10只，體重(23±2)g，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2010-0001。HPS純度84.77%：精選甘肅宕昌縣產(chǎn)紅芪，由本院藥學(xué)系進(jìn)行藥物鑒定并根據(jù)有關(guān)工藝提取。替米沙坦片(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，規(guī)格80mg×7片，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字J20090089)；尿微量白蛋白檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司，MA1361)；甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒(南京建成生物科技有限公司，C013-2)；總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒(南京建成生物科技有限公司，C011-2)；美國OMEGA總RNA提取試劑盒Ⅱ(OMEGA公司，批號(hào)：R6934)；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司，批號(hào)：RT120420)；引物合成(上海生工生物工程股份有限公司)；2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司，批號(hào)：KT201-02)；50 bp DNA Ladder Marker(北京博凌科為生物科技有限公司，批號(hào)：M07-01。)；強(qiáng)生穩(wěn)步型血糖測(cè)試儀(強(qiáng)生中國有限公司)；MiniPROTEAN 3型 Western 電泳儀(上海天能科技有限公司)；CT14RD型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海天能科技有限公司)；DJ2300型凝膠成像分析儀(上海復(fù)日生物科技有限公司)；DNM-9602型酶標(biāo)儀(美國Bio-rad公司)。

1.2分組及給藥動(dòng)物飼養(yǎng)于通風(fēng)清潔櫥中，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，進(jìn)食普通飼料。50只db/db小鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組10只，于6周齡時(shí)對(duì)小鼠分別實(shí)施灌胃治療，1次/d，連續(xù)灌胃8 w。HPS高、中、低劑量組分別給予600、300 和100 mg /kg HPS灌胃；替米沙坦組給予替米沙坦5 mg /kg灌胃；模型組給予等體積生理鹽水灌胃；正常組為同月齡同背景非轉(zhuǎn)基因db/m小鼠，給予等體積生理鹽水灌胃。HPS用蒸餾水配制，給藥體積為0.2 ml。

1.3取材及處理以上各組小鼠均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，灌胃給藥8 w后，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d代謝籠收集24 h尿液并記錄24 h尿量，小鼠處理前稱重，眼球取血，分離血清，-20℃保存。取雙側(cè)腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后稱重，剝離左側(cè)腎臟分別置于EP管中，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆糜谀孓D(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和免疫蛋白印跡檢測(cè)；剝離右腎，腎皮質(zhì)以10%甲醛固定，石蠟包埋，制成2～4 μm切片備用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)及HE染色。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.124 h尿蛋白總量的測(cè)定用酶聯(lián)免疫法測(cè)定，按照試劑盒說明書(BBC法)步驟測(cè)定24 h尿蛋白總量。

1.4.2TG、TC的測(cè)定按試劑盒說明書分別采用酶耦聯(lián)速率法和苦味酸法(除蛋白)檢測(cè)。

1.4.3PKC mRNA的檢測(cè)稱取左腎臟組織50 mg，按試劑盒說明書提取總RNA，用微量核酸蛋白分析儀計(jì)算所提RNA含量和純度。取總RNA 2 μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，β-actin上游引物5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'，下游引物：5'-CCACAGGATTCCATACCCAA-3'；TIMP-1 上游引物：5'CCAGAAATCAACGAGACCACC 3'，下游引物：5'AGAGTACGCCAGGGAACCAAG3'；β-actin、TIMP-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為：446 bp、150 bp。PCR擴(kuò)增條件(25 μl體系)：94℃ 預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，退火溫度30 s(β-actin 54℃、TIMP-1 54℃)，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min，4℃冷卻5 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定灰度值，以β-actin mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照，以TIMP-1 mRNA值與β-actin mRNA的灰度比值表示TIMP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.4PKC蛋白表達(dá)的檢測(cè)稱取左腎組織50 mg,按試劑盒說明書提取蛋白后進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應(yīng)。采用Image Lab分析軟件對(duì)各組條帶進(jìn)行分析，將各組的整合灰度比例與內(nèi)參(β-actin)比較，并以β-actin 的ID為100%，得到相對(duì)百分?jǐn)?shù)，即：(ID/內(nèi)參ID)× 100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件組間差異采用ANOVA單因素方差分析，LSD方法進(jìn)行多重組間比較。

2結(jié)果

2.1各組小鼠血糖比較與正常組比較，各組小鼠血糖明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，HPS中劑量組血糖明顯下降(P<0.01)，HPS高劑量組血糖明顯下降(P<0.05)，替米沙坦組及HPS低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

2.2各組小鼠體重的比較與正常組比較，各組小鼠體重明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，HPS中劑量組體重明顯下降(P<0.01)，HPS高劑量組體重明顯下降(P<0.05)，替米沙坦組及HPS低劑量組數(shù)據(jù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

組別治療前治療后2w治療后4w治療后6w治療后8wHPS高劑量組20.15±1.592)23.35±2.132)3)24.10±2.472)3)5)26.73±2.862)3)27.75±3.022)3)HPS中劑量組20.23±1.152)22.09±1.252)4)5)23.531.812)4)5)25.712.442)4)5)26.32.872)4)6)HPS低劑量組20.04±2.732)23.72±2.012)3)24.14±3.612)27.04±2.721)28.11±3.131)替米沙坦組20.44±2.302)22.84±1.672)24.84±2.932)27.96±3.871)28.08±3.291)模型組19.96±1.322)23.08±1.942)24.93±1.592)27.12±3.612)28.87±3.782)正常組6.15±0.826.47±0.696.95±1.146.39±1.766.63±1.43F/P值23.33/0.00129.51/0.00232.22/0.00282.30/0.00142.56/0.00

與正常組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05,4)P<0.01；與替米沙坦組比較：5)P<0.05,6)P<0.01；下表同

2.3各組小鼠24 h尿蛋白總量的比較在治療第4周，與正常組比較，各組小鼠24 h蛋白總量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，各干預(yù)組24 h尿蛋白總量均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HPS高、中劑量組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療第8周，與正常組比較，各組小鼠24 h蛋白總量均明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，各干預(yù)組24 h尿蛋白總量均明顯下降(P<0.01)，見表3。

2.4各組小鼠BUN和Scr的比較與正常組比較，各組小鼠BUN和TC明顯升高；與模型組比較，各干預(yù)組TG均下降(P<0.05)，且HPS中劑量組下降明顯(P<0.01)，見表3。

2.5各組小鼠腎臟PKC蛋白與TIMP-1 mRNA的表達(dá)的比較見表3，圖1，圖2。

組別治療前治療后2w治療后4w治療后6w治療后8wHPS高劑量組34.93±3.592)39.87±5.062)3)45.96±4.862)3)48.27±4.962)3)51.50±3.812)3)HPS中劑量組35.26±2.452)38.26±3.712)4)5)42.64±3.152)4)6)46.35±4.532)4)5)49.96±5.242)4)6)HPS低劑量組35.92±3.882)41.94±2.952)47.88±2.572)48.87±3.512)3)52.94±3.152)替米沙坦組35.06±2.802)41.14±3.542)46.34±4.262)3)48.62±3.102)3)52.88±4.712)模型組35.31±2.542)42.51±2.742)48.22±3.372)50.55±3.212)53.15±3.262)正常組20.37±2.8221.01±2.0921.74±2.3321.69±2.9621.85±2.73F/P值66.07/0.00108.33/0.00276.63/0.00184.21/0.00256.64/0.00

組別甘油三酯(mmol/L)總膽固醇(mmol/L)24h尿微量白蛋白(g/24h)治療4w治療8wTIMP-1基因PKC蛋白HPS高劑量組4.17±0.442)4)5)6.19±0.482)3)5)15.00±2.042)4)31.56±3.402)4)0.75±0.182)3)1.05±0.292)3)HPS中劑量組3.48±0.322)4)6)5.01±0.352)4)6)11.24±2.732)4)6)26.52±2.512)4)6)0.90±0.194)5)0.84±0.211)4)6)HPS低劑量組4.16±0.472)4)5)6.62±0.482)3)18.12±3.202)3)45.73±5.822)4)5)0.61±0.392)1.16±0.292)替米沙坦組5.42±0.442)3)7.29±0.422)3)14.64±2.222)3)34.23±3.912)4)0.75±0.582)3)5)1.18±0.282)模型組6.14±0.792)7.78±0.182)36.65±3.612)69.99±4.272)0.60±0.392)1.31±0.332)正常組1.88±0.331.59±0.146.43±1.304)6.55±0.954)1.02±0.564)0.59±0.144)F/P值102.75/0.00300.52/0.0071.42/0.00112.95/0.009.938/0.009.999/0.00

A：HPS高劑量組；B：HPS中劑量組；C：HPS低劑量組；D：替米沙坦組；E：模型組；F：正常組；下圖同 圖1　RT-PCR法檢測(cè)各組小鼠腎臟 組織中TIMP-1 mRNA表達(dá)

圖2　各組小鼠腎臟組織中PKC蛋白表達(dá)

3討論

糖尿病引起的腎臟損害已成為導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)最重要的原因之一。DN發(fā)生發(fā)展受多方面因素的影響，主要包括代謝因素、血流動(dòng)力學(xué)因素、氧化應(yīng)激、炎癥和遺傳因素等。臨床上早期表現(xiàn)主要為腎小球?yàn)V過率(GFR)增加，然后出現(xiàn)微量白蛋白尿、蛋白尿，最終可導(dǎo)致腎衰竭。在病理過程中最早表現(xiàn)為腎臟的增大，隨著病程延長腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)增多，進(jìn)一步發(fā)展可以出現(xiàn)腎小球硬化性病變。

PKC在高糖刺激下可被激活，可刺激系膜細(xì)胞，使Ⅳ型膠原及纖維連接蛋白過度表達(dá)〔4〕，表明PKC活化可直接或間接引起ECM合成增加，因此PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在DN形成中可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用。高糖刺激下PKC活化及促有絲分裂蛋白酶(MAPK)活性增加，轉(zhuǎn)化生長因子-β及糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)產(chǎn)生增加，它們共同作用導(dǎo)致ECM合成增加〔5，6〕。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的主要作用是特異性降解ECM，而TIMPs主要抑制MMPs的活性，DM動(dòng)物模型腎組織中MMPs的表達(dá)和活性下降，TIMPs的表達(dá)和活性增強(qiáng)〔7〕，因此其在ECM的降解中起重要作用。腎小球ECM積聚是引起腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張、毛細(xì)血管基底膜增厚，從而成為引起DN的主要病理基礎(chǔ)。因此可以通過增強(qiáng)TIMP-1的表達(dá)，降低PKC的表達(dá)來延緩DN的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同劑量的對(duì)PKC降低的程度不同，其中中劑量組效果最佳且優(yōu)于西藥替米沙坦，因此在延緩DN發(fā)展中HPS具有很好的療效，且其劑量應(yīng)嚴(yán)格掌握。HPS是從甘肅地道藥材紅芪(Hedysarum Polybotrys Hand.-mazz)中提取的有效成分，主要有補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效〔8〕。在現(xiàn)代研究中還發(fā)現(xiàn)紅芪具有降血壓、降血糖、降血脂的效果〔9〕；HPS可有效抑制早期腎組織勻漿中的NO增高,降低NOS活性，NO產(chǎn)生和(或)活性減少,從而保護(hù)胰腺β細(xì)胞，使腎小球高濾過高灌注較早期有所控制。

綜上所述,HPS對(duì)于DN的治療可能是通過抑制PKC信號(hào)通路來控制DN的進(jìn)展，PKC、 TIMP-1可共同調(diào)節(jié)腎小球系膜外基質(zhì)的形成與降解,影響DN的進(jìn)程。因此,選擇適當(dāng)藥物阻止PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活或增強(qiáng)TIMP-1活性可能成為預(yù)防和治療DN的有效方法。

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〔2014-11-19修回〕

(編輯李相軍)