山姜素對急性重癥胰腺炎大鼠肺損傷中水通道蛋白-1表達的影響

山姜素對急性重癥胰腺炎大鼠肺損傷中水通道蛋白-1表達的影響

聶容榮袁晟光1劉杰1余水平1唐芳2唐博1

(桂林醫學院附屬醫院中醫科,廣西桂林541001)

摘要〔〕目的探討山姜素對急性重癥胰腺炎(SAP)肺損傷的保護作用是否與水通道蛋白(AQP)-1表達相關。方法選取60只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組(Control組)，假手術組(Sham組)、模型組(SAP組)、山姜素治療組(Alpinetin組)每組15只。以逆行注入15 g/L 熊去氧膽酸鈉(1 ml/kg)30 s注射制作SAP模型。各組均于造模8 h后剖殺，提取肺組織。檢測肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性、濕/干重比及對肺臟進行病理學評分；取材測定血清腫瘤壞死因子(TNF)-α含量；RT-PCR檢測肺組織AQP-1 mRNA的表達，免疫組化法檢測肺組織AQP-1的表達。結果SAP組與Sham組相比，SAP組肺組織損害程度明顯升高(P<0.01)，血清TNF-α，MPO活性明顯增加(P<0.05)。AQP-1 mRNA與AQP-1蛋白表達顯著下調(P<0.05)。Alpinetin組與SAP組相比，Alpinetin組肺干/濕比值、肺組織病理損害程度、血清TNF-α明顯降低(P<0.05)，AQP-1 mRNA和AQP-1蛋白表達則明顯升高(P<0.05)，AQP-1表達水平與TNF-α呈負相關。結論應用山姜素能夠對SAP肺損傷起到明顯的保護作用，其機制可能與抑制肺組織分泌TNF-α和上調AOP-1水平有關。

關鍵詞〔〕山姜素；急性重癥胰腺炎；肺損傷；水通道蛋白-1

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：廣西壯族自治區中醫藥管理局中醫藥科技專項基金資助(GZPT13-45)

通訊作者：唐博(1979-)，男，副主任醫師，博士，主要從事肝膽胰外科臨床與基礎研究。

1桂林醫學院附屬醫院肝膽外科2桂林醫學院附屬醫院病理科

第一作者：聶容榮(1981-)，男，副主任醫師，博士，主要從事中醫肝病臨床與基礎研究。

急性重癥胰腺炎(SAP)病情兇險，死亡率高，嚴重者導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)，從而導致多器官障礙〔1,2〕。其中最常見的是急性肺損傷(ALI)〔3〕，是臨床上難治之癥。SAP在中醫學中屬于“胃脘痛”、“脾心痛”范疇。《內經》有言，肺與大腸相表里。若肺臟功能失調，易致大腸之氣發生郁塞。此時如能通導大腸，使得大腸腑氣得以通調，則可促使肺之肅降功能恢復正常。肺為相傅之官而朝百脈，百脈順，則諸癥可解〔4〕。本課題前期進行了山姜素治療SAP的臨床預實驗，抗ALI效果令人滿意。本研究旨在進一步明確山姜素是否通過上調水通道蛋白(AQP)-1的表達來達到減輕ALI的效果。

1材料與方法

1.1實驗動物雄性SD大鼠60只，體重(250±20)g。動物分籠飼養，自由飲水，喂標準顆粒飼料，室溫(20±2)℃，動物及飼料均購由桂林醫學院實驗動物中心提供。實驗研究經過桂林醫學院附屬醫院倫理委員會的批準。

1.2藥品及試劑山姜素購自美國Sigma公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α的ELISA檢測試劑盒，髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒，AQP-1抗體、免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司。

1.3動物模型與分組大鼠隨機分為正常對照組(Control組)、假手術組(Sham組)、模型組(SAP組)、山姜素治療組(Alpinetin組)，每組15只。所有大鼠禁食、自由飲水12 h，1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。正常對照組不做任何手術處理。Sham組模擬造模手術情況，開腹后僅輕度揉搓胰腺、翻轉腸管5 min后即關腹。SAP組采用20 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，動物腹部剃毛，消毒術區皮膚，無菌條件下經正中切口入腹，在十二指腸乳頭對側腸壁插入1 ml小注射器針頭經胰腺膽管十二指腸乳頭開口入胰膽管，同時在膽管出肝門處用小動脈夾夾閉，逆行注入15 g/L熊去氧膽酸鈉(1 ml/kg)30 s注射造模。Alpinetin組在SAP造模后0.5 h內，灌服山姜素80 mg/ml。

1.4標本采集及檢測各組大鼠造模或術后8 h后處死，經腹主動脈采血，離心后血清置-70℃冰箱保存備用。

1.4.1肺干/濕比值測定動物放血致死后無菌操作下取左肺葉稱濕重，置60℃烤箱連續烘烤24 h，去除水分后稱干重。

1.4.2肺組織病理形態觀察無菌操作下取出右肺下葉行常規甲醛固定、石蠟包埋，切片5 μm，HE染色觀察，并行病理學評分。

1.4.3血清MPO及TNF-α含量測定大鼠解剖胸腔暴露肺，夾閉右肺下葉支氣管。自主支氣管灌入無菌生理鹽水，每次8 ml，共5次，收集灌洗液。將灌洗液以2 000 r/min離心10 min，棄去上清。將沉淀用RPMI1640培養液懸浮，計數細胞，調整細胞濃度為1×106/ml，置24孔細胞培養板中。于37℃、5% CO2中培養1 h，用溫培養液沖洗2次，去除未黏附細胞。然后將黏附細胞再置于培養液中培養24 h，取上清用于檢測 TNF-α。TNF-α與MPO檢測用ELLSA法。

1.4.4肺組織中AQP-1免疫組化檢測取右肺組織常規脫水、包埋制成蠟塊，用于免疫組化染色，采用SP法，PBS代替一抗作為陰性對照，按免疫組化試劑盒說明書操作。

1.4.5肺組織中AQP-1 mRNA表達檢測取右肺組織，提取總RNA。RT-PCR采用一步法。AQP-1引物設計，上游為：5′-ATGGCCAGCGAAATCAAGAAG-3′，下游引物為5′-GATATCATCAGCATCCAGGTC-3′。β-actin作為內參照，其引物設計：上游為5′-GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3′，下游為5′-CATGAGGTAGTCTGTCAGGTC-3′。PCR反應條件：94℃預變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸10 s，循環30次，72℃延伸1 min，最后降至4℃結束反應。PCR產物在瓊脂糖凝膠中電泳后采用凝膠成像系統記錄分析。

1.4.6肺組織中AQP-1蛋白表達Western印跡分析肺組織AQP-1蛋白表達代替。

1.5統計學方法采用SPSS18.0統計軟件行方差分析。

2結果

2.1大鼠一般情況及死亡率觀察Control組與Sham組大鼠一般狀況較好，術后無死亡發生。SAP組大鼠一般狀況差，出現精神萎靡、反應遲鈍、懶動、豎毛、呼吸急促、拒食等表現，24 h死亡率高達50%。Alpinetin組大鼠的一般狀況較模型組有不同程度的改善，24 h死亡率也有顯著下降。

2.2肺臟病理學評分Control組與Sham組肺臟病理學大體觀：肺臟形態、結構基本正常。SAP組肺臟表面暗紅并伴有點片狀出血灶，水腫明顯。Alpinetin組肺臟見少量出血點，水腫輕。肺泡腔融合形成肺大泡.隨著時間延長，上述表現呈逐漸加重趨勢。按文獻〔5〕肺組織病理評分標準，Control組組織學評分顯著高于Sham組〔(0.41±0.43) vs(0.37±0.48),P<0.01〕，而Alpinetin組肺組織炎癥反應明顯減輕〔(0.81±0.48)〕，組織學評分顯著低于SAP組〔(1.93±0.64),P<0.01〕。

2.3血清及肺組織各項指標表1可見，Sham組、Alpinetin組

組別TNF-α(μg/L)MPO(U/g)肺濕/干重比AQP-1mRNAAQP-1蛋白Control組56.31±5.822.82±0.426.53±0.380.782±0.026197±6Sham組74.31±6.433.42±0.726.31±0.250.812±0.029201±7SAP組216.8±15.1311.32±1.269.75±0.370.362±0.01197±5Alpinetin組100.48±30.121)6.91±1.721)6.62±0.411)0.773±0.0121)162±81)F/P值13.37/08.01/021.95/097.78/026.68/0

與SAP組比較：1)P<0.05

與SAP組相比血清TNF-α，MPO水平明顯降低(P<0.05)。SAP組肺干/濕比值明顯增加，Alpinetin組與其相比肺干/濕比值減少(P<0.05)。SAP組AQP-1 mRNA表達較Sham組顯著下調(P<0.05)，而Alpinetin組較SAP組AQP-1 mRNA表達明顯上調(P<0.05)(圖1)。SAP組AQP-1蛋白表達較Sham組明顯下調(P<0.05)，Alpinetin組AQP-1蛋白表達較SAP組明顯上調(P<0.05)(圖2)。

圖1　各組大鼠造模后肺組織AQP-1 mRNA表達結果

圖2　各組大鼠造模后肺組織AQP-1蛋白表達結果

3討論

SAP并發ALI〔3〕，其病情發展迅速，死亡率高，是臨床上難治之癥。ALI治療的難點之一是因為胰源性肺損傷的發病機制不甚明了。目前研究表明，胰源性肺損傷的發病機制與一系列因素有關，如細胞因子與炎癥介質過度釋放〔6，7〕，細胞凋亡〔8〕，中性粒細胞及巨噬細胞過度積聚〔7〕等。TNF-α是其中較為重要的炎癥介質〔9，10〕。MPO是一種重要的含鐵溶酶體，是中性粒細胞的功能標志和激活標志，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細胞(PMN)的功能和活性狀態，對機體產生和調節炎癥反應等多方面發揮作用〔11〕。

AQP是與水的快速轉運密切相關的細胞膜蛋白家族〔12,13〕，現已發現11種亞型，在肺組織內分布的有AQP-1、AQP-3、AQP-4、AQP-5四種，其中肺微血管內皮細胞中AQP-1含量相對較高〔14〕。AQP-1已經被證實參與了多種肺損傷性疾病的病理過程〔15〕。AQP-1在SAP并ALI時表達與肺水腫的嚴重程度呈負相關〔13〕。SAP在中醫學中屬于“胃脘痛”、“脾心痛”范疇。《靈樞·本輸》云：“肺合大腸”，肺屬太陰，大腸屬陽明。五行同屬金。肺與大腸生理上相互協調，病理上相互影響，治療上相互為用。現代研究表明〔14〕，消化管、呼吸道的上皮組織大多來源于原始消化管的內胚層，這種胚胎學上的共同來源被認為是“肺與大腸相表里”的生理結構基礎。中醫學認為，SAP病程中，因肺失肅降，使得大量的有毒物質積聚體內，腸道也因此發生傳導阻滯，出現腑實壅盛，里熱積聚等證。此時如能選取合適的方法通利大腸，使腸腑之氣得以通降，則肺之肅降功能也可恢復正常，肺氣喘逆等癥也能隨之改善。

《名醫別錄》載：豆蔻味辛，溫，無毒。主溫中、心腹痛、嘔吐。草豆蔻具有燥濕健脾、溫胃止嘔的功效，在中醫臨床上用于寒濕內阻、脘腹冷痛、噯氣呃逆、不思飲食等癥。山姜素是姜科植物草豆蔻種子團中的主要成分，其結構式分別為7-羥基-5-甲氧基二氫黃酮。現代藥理學研究表明，山姜素具有明顯的抗菌、抗炎作用〔16，17〕。前期臨床預實驗表明，山姜素具有通里攻下作用，能促進胃腸道排空，減少腸道細菌易位，從而起到清熱解毒，抑制肺組織多種細胞因子及炎癥介質的釋放，發揮通腑保肺的作用。本實驗說明山姜素可有效抑制中性粒細胞在肺組織的聚集，進而減輕SAP并發的ALI。因此，山姜素對SAP肺組織具有較全面的保護作用，可能是上調AQP-1的表達來抑制TNF-α的分泌，達到減輕肺損傷的效果。

4參考文獻

1Halonen KI，Pettil? V，Lepp?niemi AK，etal.Multiple organ disfunction associated with severe acute pancreatitis〔J〕.Crit Care Med，2002；30(6)：1274-9.

2Yuan Z，Meyerholz DK，Twait EC，etal.Systemic inflammation with multiorgan dysfunction is the cause of death in murine ligation-induced acute pancreatitis〔J〕.Gastrointest Surg，2011；15(10)：1670-8.

3Pastor CM，Matthay MA，Frossard JL.Pancreatitis-associated acute lung injury：new insights〔J〕.Chest，2003；124(6)：2341-51.

4王仲霞.肺與大腸相表里的理論及臨床研究進展〔J〕.北京中醫，2006；25(7)：438-40.

5雷文章，韋靖江.實驗性壞死性胰腺炎多器官損害與內毒素血癥的關系〔J〕.中華實驗外科雜志，1995；12(1)：131-2.

6Huai JP，Sun XC，Chen MJ，etal.Melatonin attenuates acute pancreatitis-associated lung injury in rats by modulating interleukin 22〔J〕.World J Gastroenterol，2012；18(36)：5122-8.

7Akbarshahi H，Rosendahl AH，Westergren-Thorsson G，etal.Acute lung injury in acute pancreatitis-awaiting the big leap〔J〕.Respir Med，2012；21(9)：1199-210.

8Weng TI，Wu HY，Chen BL，etal.Honokiol attenuates the severity of acute pancreatitis and associated lung injury via acceleration of acinar cell apoptosis〔J〕.Shock，2012；37(5)：478-84.

9Kyl?np?? L，Rakonczay Z Jr，O′Reilly DA.The clinical course of acute pancreatitis and the inflammatory mediators that drive it〔J〕.Int J Inflam，2012；2012：360685.

10徐軍，張梅，劉學民，等.TNF-α基因表達在大鼠急性重癥胰腺炎肺損傷中的作用〔J〕.西安交通大學學報，2004；8(4)：388-9,392.

11陳平，王文聞，王剛，等.一氧化碳釋放分子對重癥急性胰腺炎肺損傷保護作用的實驗研究〔J〕.中華肝膽外科雜志，2010；16(3)：196-9.

12Jiao G，Li E，Yu R.Decreased expression of AQP1 and AQP5 in acute injured lungs in rats〔J〕.Chin Med J(Engl)，2002；115(7)：963-7.

13Su X，Song Y，Jiang J，etal.The role of aquaporin-1(AQP1) expression in a murine model of lipopolysaccharide-induced acute lung injury〔J〕.Respir Physiol Neurobiol，2004；142(1)：1-11.

14Bai C，Fukuda N，Song Y，etal.Lung fluid transport in aquaporin-1 and aquaporin-4 knockout mice〔J〕.Clin Invest，1999；103(4)：555-61.

15Towne JE，Harrod KS，Krane CM，etal.Decreased expression of aquaporin(AQP)1 and AQP5 in mouse lung after acute viral infection〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol，2000；22(1)：34-44.

16Sala A，Recio MC，Schinella GR，etal.Assessment of the anti-inflammatory activity and free radical scavenger activity of tiliroside〔J〕.Eur J Pharmacol，2003；461(1)：53-61.

〔2014-04-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

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