綠茶提取物對運動大鼠腓腸肌游離脂肪酸含量及激素敏感性脂肪酶蛋白表達的影響

綠茶提取物對運動大鼠腓腸肌游離脂肪酸含量及激素敏感性脂肪酶蛋白表達的影響

李敏華唐健雷麗1

(廣西師范大學體育學院，廣西桂林541004)

摘要〔〕目的研究綠茶提取物在運動中對機體肌肉組織中能量代謝的作用。方法SD雄性大鼠50只，隨機分為5組，每組10只，分別為安靜對照組，運動對照組，低劑量綠茶提取物組(TPEL)，中劑量綠茶提取物組(TPEM)，高劑量綠茶提取物組(TPEH)。每天在運動前30 min灌胃1次，連續灌胃6 w，6 d/w，低、中、高劑量組分別為5,10,15 g·kg-1·d-1，對照組灌胃等量生理鹽水。6 w力竭訓練結束后，宰殺大鼠。根據試劑盒的方法測定大鼠腓腸肌游離脂肪酸(FFA)含量和Western印跡法測定大鼠腓腸肌組織激素敏感性脂肪酶(HSL)蛋白表達。結果力竭游泳訓練導致大鼠腓腸肌FFA含量均顯著升高，綠茶提取物組大鼠高于安靜對照組(P<0.01)和運動對照組(P<0.05)。力竭游泳運動和綠茶提取物各組大鼠腓腸肌HSL 蛋白表達水平升高綠茶提取物組大鼠高于安靜對照組和運動對照組(P<0.01)，TPEM、TPEH組與運動對照組比較有顯著差異(P<0.01)。結論綠茶提取物能夠促進肌內脂肪酸合成為運動供能并調節脂質代謝。

關鍵詞〔〕綠茶提取物；力竭運動；游離脂肪酸；激素敏感性脂肪酶

中圖分類號〔〕G804.2〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：廣西科學研究與技術開發計劃項目(11107022-3);廣西醫藥產業人才小高地項目(1109)

1桂林醫學院附屬醫院腎臟內科

第一作者：李敏華(1977-)，女，碩士，講師，主要從事運動生理學與生物化學研究。

綠茶提取物(TPE)由茶多酚、咖啡堿、芳香油、礦物質、色素、氨基酸、類脂、維生素等眾多成分組成。在這些成分中，茶多酚、咖啡堿、芳香油對茶葉的質量與飲茶的功效關系最為密切〔1，2〕。有研究表明TPE是一種優良的天然抗氧化劑具有抗癌、降血脂、抗病毒、減肥、保護心肌和增強免疫功能等功效〔3～5〕。在運動領域，屈萍等〔6〕研究認為TPE能有效抑制和修復無氧運動造成的骨骼肌損傷，增強機體的抗氧化能力，促進運動性疲勞的消除。本研究探討運動前補充TPE對力竭運動大鼠腓腸肌游離脂肪酸(FFA)含量及激素敏感性脂肪酶(HSL)蛋白表達變化的影響。

1材料與方法

1.1動物SD雄性健康大鼠50只，體重(200±10)g，購自桂林醫學院實驗動物中心，SPF 級，許可證號:SCXK(桂)2007-0001。在整個實驗過程中，實驗室內溫度保持在(23 ± 3)℃，相對濕度55%～75%，光照時間隨自然變化。所有實驗大鼠均以基礎飼料(桂林醫學院實驗動物科學部提供)和蒸餾水常規飼養，自由飲食。

1.2藥物及試劑TPE(桂林興達制藥有限責任公司，批號20121127，純度≥60%)，FFA試劑盒(美國Phoenix Biotech 公司，批號E0612)，HSL、β-actin 抗體為鼠單抗(一抗體，美國 Santa Cruz公司，批號C20117)，羊抗鼠IgG(二抗體，北京中杉金橋生物公司，批號2012323)，NC膜(美國Millipore公司，批號A910347)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒(香港昊柏生物科技有限公司，批號20120301)。

1.3儀器Bio-Rad電泳儀、垂直電泳槽及半干轉膜儀(美國伯樂儀器有限公司)，BioTek多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；3k15高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；化學發光成像系統(美國Carestream公司)；大型冷凍空氣恒溫搖床(DHZ-032R,上海博彩科技公司)。

1.4動物分組為使實驗大鼠適應新環境，首先將購回的大鼠分籠適應性喂養6 d后隨機分組，每組10只，分別為安靜對照組，運動對照組，低、中、高劑量組(TPEL、TPEM、TPEH組)。大鼠在訓練前30 min灌胃不同濃度TPE溶液，劑量分別為5,10,15 g·kg-1·d-1，灌胃體積為5 ml/kg，對照組灌胃等量生理鹽水，各組大鼠連續灌胃6 w，1次/d，直到實驗結束。

1.5方法各訓練組大鼠均采用游泳運動。動物游泳池的規格為長100 cm寬50 cm高60 cm的玻璃泳槽，水深50 cm，水溫(31±2)℃。為防止大鼠在水面漂浮不動，特在游泳箱底部放置佳寶“AP1500”型水泵形成流動水。訓練共6 w，大鼠于每天上午8：00進行負重游泳訓練(大鼠每只尾部負自身體重3%的鉛墜進行游泳〔7〕)，運動至力竭，1次/d，6 d/w，每次游泳訓練至力竭。對于短時間內力竭的大鼠，撈出休息5 min后，再進行游泳訓練，使訓練時間不少于60 min。力竭標準：大鼠頭部沉入水下超過10 s仍不再返回水面；大鼠協調運動消失，在水中不定向亂竄，未達到10 s 亦定為力竭。

1.6樣本采集6 w力竭運動結束后取材，取材前大鼠禁食12 h以上，訓練組停訓24 h。用20%烏拉坦溶液(2.5 ml/kg)腹腔注射麻醉，冰上迅速解剖取其大鼠右腿腓腸肌組織，4℃生理鹽水清洗，剪成小塊裝入凍存管中，先置液氮中，后轉入-80℃冰箱中待測。

1.7FFA含量指標的測試準確稱取0.20 g腓腸肌組織待測樣品，加入生理鹽水，在低溫條件下仔細研磨，制成體積比為10%的勻漿液，以4 000 r/ min 轉速離心15 min(0～4℃) 后取上清液于冰浴中測定FFA的含量，測定方法嚴格按試劑盒提供的步驟進行。

1.8Western印跡法測定大鼠腓腸肌組織HSL蛋白表達制備樣品蛋白：取腓腸肌標本以生理鹽水充分沖洗后，把組織剪切成細小的碎片，裂解液裂解，冰上勻漿，至充分裂解。離心，取上清-20℃保存。①電泳：安裝電泳槽，配制15% SDS-PAGE分離膠，灌膠，封膠。配制5%的濃縮膠，灌膠，上梳，填滿空隙，放置30 min，去離子水洗滌。放入電泳槽，倒入電泳緩沖液，加樣品，樣品在沸水中煮沸，每井10 μl。80 V 20 min后調至120 V電泳1 h左右，至溴酚藍跑出膠板。染色4 h，脫色5 h。②免疫印跡：將凝膠移至盛有水的平皿中，浸洗3次，轉移至電泳緩沖液中，室溫浸泡3 h。準備NC膜，濾紙，NC光面向上，凝膠置于其上，放入電轉移槽。14 V，100 mA，轉印2 h。封閉過夜。NC置于單克隆抗體HSL(1∶300)液中，緩搖2 h。 PBS/T洗膜3次，每次15 min，將NC置于1∶2 000稀釋的羊抗鼠IgG，室溫緩搖2 h。PBS/T洗膜3次，每次10 min，將NC置于DAB底物中反應著色拍照。③結果半定量：以β-actin代替鼠抗HSL重復免疫印跡實驗，在底片上得到內參β-actin的條帶。圖像分析系統掃描條帶灰度值，用底片上鼠抗HSL條帶的灰度值與內參β-actin條帶的灰度值的比值半定量分析的HSL蛋白表達量。

2結果

2.1力竭運動大鼠腓腸肌FFA含量的變化與安靜對照組相比，運動對照組和TPE組均引起大鼠腓腸肌FFA含量均極顯著升高(P<0.01)，補充不同劑量的TPE組大鼠較運動對照組大鼠腓腸肌FFA含量仍有顯著升高(P<0.05)。見表1。

組別FFA含量(μmol/L)HSL/β-actin安靜對照組342.63±40.050.93±0.14運動對照組626.41±38.122)3)1.62±0.101)TPEL組658.53±41.022)3)1.73±0.131)TPEM組659.62±39.232)3)2.19±0.172)4)TPEH組662.60±38.172)3)2.36±0.122)4)

2.2力竭運動大鼠腓腸肌HSL蛋白表達HSL與β-actin 條帶的灰度比較，發現運動對照組和補充不同劑量的TPE組大鼠腓腸肌HSL 蛋白表達高于安靜對照組(P<0.05)；補充不同劑量的TPE組大鼠腓腸肌HSL 蛋白表達較運動對照組高，其中在TPEM、TPEH組大鼠腓腸肌HSL 蛋白表達與運動對照組比較有極顯著差異(P<0.01)。見圖1，表1。

圖1　各組大鼠HSL蛋白表達

3討論

FFA是機體內的重要能量來源和重要的信號分子〔8〕。在運動過程中，骨骼肌FFA的主要來源于肌內甘油三酯(TG)的水解和攝取血清FFA，并且肌內脂肪酸的氧化隨血清FFA的升高而隨之加快。張雪琳等〔9〕研究發現，有氧跑臺運動后血清FFA水平升高，導致骨骼肌中解耦聯蛋白的表達上調。孫建波〔10〕研究發現，運動前補充何首烏復方可降低FFA含量。魏秀芳等〔11〕研究發現，補充山楂葉總黃酮自乳化顆粒能夠降低脂肪肝大鼠FFA含量，從而起到治療大鼠脂肪肝的作用。劉海英等〔12〕研究發現，服用槲皮素后大鼠力竭運動時間延長，FFA含量顯著提高，說明補充槲皮素能夠促進大鼠脂肪動員水解，從而提高大鼠的運動能力。本研究提示運動訓練能夠有利于脂肪動員水解，而補充不同劑量的TPE后大鼠腓腸肌FFA含量亦有顯著性升高，提示補充TPE后可能有助于大鼠體內糖儲備的提高，影響不同狀態下的脂肪代謝，促進脂肪利用的作用。

激素敏感性脂肪酶是最早發現和克隆的脂肪細胞內脂質分解酶，是脂肪組織和肌肉組織肌內TG水解的關鍵限速酶，能水解TG、甘油二酯、膽固醇酯和其他脂質及一些水溶性底物，產生Glycerol和FFA。在運動中研究HSL基因表達量來探討運動員脂肪水解具有重要的意義。Huijsman等〔13〕研究表明，急性運動引起工作肌HSL mRNA表達顯著上升。Helge等〔14〕對經常運動的婦女進行兩周高強度有氧間歇運動訓練發現，訓練后HSL蛋白含量有上升的趨勢。Enevoldsen等〔15〕研究發現，經過18 w游泳訓練大鼠腓腸肌脂肪組織HSL酶活性比安靜組升高。謝偉華等〔16〕研究發現，通過補充不同劑量的山楂黃酮能夠上調肌肉組織中HSL蛋白表達。高斌等〔17〕研究發現，補充普洱茶茶褐素可顯著增強大鼠肝臟和附睪脂肪組織HSL 活性及其mRNA 的表達。本研究顯示，力竭游泳訓練后大鼠腓腸肌HSL 蛋白表達高于安靜對照組，這與相關研究結果相一致〔13～15〕，提示運動訓練能夠引起肌肉組織的分解，從而加速體內脂肪酸的轉運和代謝。TPE能夠促進肌內脂肪酸合成同時又促進其分解代謝，但其促進分解的作用更強，提示TPE在調節脂質代謝方面具有積極的意義。

4參考文獻

1王薇.天然綠茶提取物除臭劑的開發與利用〔J〕.農牧產品開發,1996;10(10):17.

2吳正平.茶多酚對小鼠高脂血癥與脂肪肝的預防作用〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2010;16(2):94.

3Kuriyama S,Hozawa A,Ohmori K,etal.Green tea consumption and cognitive function:a cross-sectional study from the Tsurugaya Project〔J〕.Am J Clin Nutr,2006;83(2):355.

4宿迷菊,王岳飛,駱耀平,等.茶多酚抗炎作用研究進展〔J〕.茶葉,2006;32(1):10.

5馬森,游玉瓊,游洪忠.武夷巖茶、綠茶在小鼠上抗缺氧作用的研究〔J〕.畜牧獸醫雜志,2008;27(3):5.

6屈萍,鄭偉濤.綠茶提取物對消除無氧性運動疲勞的作用〔J〕.體育學刊,2010;17(9):101.

7Thomas DP,Marshall KI.Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrance structures〔J〕.Int J Sports Med,1988;9(4):257.

8Tripsthy D,Mohanty P,Syed T,etal.Elevation of free acids induces inflammation and impairs vascular reactivity in healthy subject〔J〕.Diabetes,2003;52(12):2882.

9張雪琳,何玉秀,姚玉霞.跑臺運動對大鼠骨骼肌UCP3 mRNA表達與血清FFA 水平的影響〔J〕.中國運動醫學雜志,2008;27(2):153.

10孫建波.何首烏復方結合90分鐘游泳運動對高脂飲食大鼠相關指標的影響〔D〕.揚州:揚州大學,2006.

11魏秀芳,梁鈺華,李遠瑾,等.山精葉總黃酮自乳化顆粒對大鼠非酒精性脂肪肝的防治作用〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2013;19(14):219.

12劉海英,熊正英,張軍風.槲皮素對運動訓練大鼠能源物質代謝的影響〔J〕.西北農林科技大學學報:自然科學版,2005;33(4):21.

13Huijsman E,VandePar C,Economou C,etal.Adipose triacylglycerol lipase deletion alters whole body energy metabolism and impairs exercise performance in mice〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab,2009;297(2):E505.

14Helge JW,Biba TO,Galbo H,etal.Muscle triacylglycerol and hormone-sensitive lipase activity in untrained and trained human muscles〔J〕.Eur J Appl Physiol,2006;97(5):566.

15Enevoldsen LH,Stallknecht B,Langfort J,etal.The effect of exercise training on hormone-sensitive lipase in rat intra-abdominal adipose tissue and muscle〔J〕.Physiology,2001;536(9):877.

16謝偉華,孫超,劉淑敏.山楂黃酮對高脂血模型小鼠血脂及生脂基因轉錄表達的影響〔J〕.中國中藥雜志,2009;34(2):224.

17高斌,彭春秀,龔加順,等.普洱茶茶褐素對大鼠激素敏感性脂肪酶活性及其mRNA 表達的影響〔J〕.營養學報,2010;32(4):362.

〔2014-06-18修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)