貝母素甲對內毒素性急性肺損傷小鼠炎癥因子表達的影響

貝母素甲對內毒素性急性肺損傷小鼠炎癥因子表達的影響

歸改霞夏西超馬瑜紅梁桂娜丁可劉榮志

(南陽醫學高等專科學校基礎醫學部，河南南陽473061)

摘要〔〕目的探討貝母素甲(PM)對脂多糖(LPS)誘導小鼠急性肺損傷過程中炎癥因子表達的影響。方法80只昆明種小鼠體重(20±5)g隨機分成正常組、模型組、地塞米松(Dex)組、PM組，腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉小鼠，模型組、Dex組及PM組小鼠給予氣管內注射4 mg/kg LPS誘導建立急性肺損傷模型。注入LPS前1、12、24 h和36 h和注入后12 h，24 h和36 h，模型組、Dex組、PM組動物分別給予生理鹽水、10 mg/kg鹽酸地塞米松、1 mg/kg PM溶液，正常組給予同等體積生理鹽水。實驗結束后解剖肺臟，觀察肺臟形態學改變，分別用Real-Time PCR和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定腫瘤細胞壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-2、IL-6和IL-8。結果LPS能明顯引起小鼠肺部的炎癥反應，PM處理后拮抗了LPS對小鼠肺組織的破壞作用，抑制促炎因子TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8的表達。結論PM對急性肺損傷小鼠肺組織保具有保護作用，其機制可能與下調炎癥因子的表達有關。

關鍵詞〔〕貝母素甲；急性肺損傷；腫瘤壞死因子；白介素-2；白介素-6；白介素-8

中圖分類號〔〕R363〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河南省重點科技攻關項目(122102310103)

通訊作者：劉榮志(1970-)，男，教授，主要從事細胞增殖分化調控研究。

第一作者：歸改霞(1977-)，女，講師，主要從事細胞增殖分化調控研究。

炎癥反應在急性肺損傷(ALI)發生發展過程中起關鍵作用〔1～3〕。貝母是百合科多年生草本植物，是常用的治療肺部炎癥的中藥，具有清熱化痰、解毒等作用〔4～6〕。貝母素甲(PM)為貝母的主要活性成分之一，屬于生物堿類物質〔7，8〕，但其在ALI中的應用未見報道。本研究擬建立小鼠ALI模型，觀察肺組織病理學改變，檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-2、IL-6和IL-8的mRNA和蛋白含量的變化。

1材料和方法

1.1主要試劑PM、脂多糖(LPS)、地塞米松(Dex)、均購自阿拉丁試劑有限公司，Trizol試劑、RTase M-MLV，dNTP mixture、SYBR Premix Ex TaqTM等購自大連寶生物生物工程有限公司，引物合成由上海生工生物工程公司合成，酶聯免疫(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，PM的配制：稱取1 mg后，加入雙蒸水1 ml，加入1 mol/L HCl溶解，調pH為7.0，最終稀釋為100 μg/ml，微孔濾膜過濾除菌，分裝，4℃保存備用，其他試劑均為實驗級別。

1.2動物模型建立雄性昆明種小鼠(SPF級)80只，4～8 w齡，體質量20～30 g，購于河南省實驗動物中心，分籠飼養，自由飲水與攝食，隨機平均分為正常組、模型組、Dex組、PM組。腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉小鼠，模型組、Dex組及PM組小鼠給予氣管內注射4 mg/kgLPS誘導建立ALI模型。注入LPS前1 h、12 h、24 h和36 h和注入后12 h，24 h和36 h，五組動物分別給予生理鹽水、10 mg/kg鹽酸地塞米松、1 mg/kg PM溶液，正常組給予同等體積生理鹽水。實驗結束后解剖肺臟，液氮速凍。

1.3病理學觀察肺部病理學觀察采用HE染色方法，主要步驟：取材、固定、脫水透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、染色和封片，然后在光鏡下觀察小鼠肺部形態學觀察。

1.4肺臟TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8的mRNA水平分析RNA提取采用RNAiso Plus提取小鼠肺組織RNA，總RNA的完整性和純度分別用凝膠電泳和分光光度計檢測。按照PrimeScriptTM RT試劑盒操作說明合成cDNA第一鏈。根據目的基因和內參基因β-actin保守區域設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成，各引物序列分別為：TNF-α正義鏈5′ACTGGGCATCCTTTGTCGG3′,TNF-α反義鏈5′CTGTTGGTGAAGAGGTGCGG3′；IL-2正義鏈5′ATCGTGGGTGGCGTTGAG3′，IL-2反義鏈5′GTTCTGGCGGATGTTGTGG3′；IL-6正義鏈5′CTCAGGACGGTAAGTGTCGCTT3′，IL-6反義鏈5′TGGTAGAACTGGAAGGACGGCT3′；IL-8正義鏈5′GGGTTCCTTACTCCGCTTTCG3′，IL-8反義鏈5′GTCAGTGCCTTGGTTCAGGTCG3′；β-actin正義鏈5′CATCCACGAGACCACCTACAAC3′，β-actin反義鏈5′GAAATACTGCCTCGCTCCCTC3′。TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA水平分析采用ABI7500型 real-time PCR，反應體系SYRB Premix Ex TaqTM試劑盒要求進行。結果采用2-△△ct法進行分析。

1.5肺臟TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8蛋白含量測定TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8測定參照ELISA試劑盒要求進行。組織勻漿，離心，加入酶，37℃溫育，PBS緩沖液洗版，然后加入酶復合物，37℃溫育，PBS緩沖液洗版，加入底物，室溫溫育，最后加入終止液，在450 nm處觀察OD值。

1.6統計學方法采用SPSS10.0軟件進行ANOVA和Brown-forsythe相結合法、LSD法和Tamhane法。

2結果

2.1肺臟病理學改變正常組肺組織結構完整，肺泡腔清晰，無滲出物，肺泡壁無增厚，肺泡間質無炎性細胞浸潤，肺泡隔均勻一致。模型組肺組織的結構破壞明顯，肺泡大小不一，肺泡壁明顯水腫增寬，肺泡腔萎陷，并伴有出血，血管周圍間隙增寬，肺泡間質內有大量炎癥細胞浸潤，部分肺間隔變薄、斷裂，有肺氣腫形成。與模型組相比，PM組小鼠肺組織的損傷有明顯程度減輕。見圖1。

圖1　各組小鼠肺臟病理學結果(HE，×400)

2.2各組動物TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA水平的比較與正常組和Dex組相比，模型組TNF-α、IL-2、IL-6和 IL-8 mRNA水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，PM組TNF-α，IL-2，IL-6和IL-8 mRNA含量分別減少了53.28 %(P<0.01)，67.93%(P<0.01)、59.09%(P<0.01)和54.42 %(P<0.01)。見表1。

組別TNF-αIL-2IL-6IL-8正常組0.64±0.130.87±0.090.71±0.110.77±0.199模型組2.59±0.362)3.68±0.542)1.98±0.332)2.26±0.452)Dex組1.11±0.181)4)1.07±0.244)1.25±0.311)3)1.31±0.221)3)PM組1.21±0.341)4)1.18±0.274)0.81±0.204)1.13±0.324)

與正常組比較：1)P<0.05,2)P<0.01，與模型組比較：3)P<0.05,4)P<0.01，下表同

2.3各組動物TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8蛋白水平的比較ELISA結果顯示，與正常組和Dex組相比，模型組TNF-α，IL-2，IL-6和 IL-8蛋白水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，PM治療組TNF-α，IL-2，IL-6和IL-8蛋白含量分別減少了71.71 %(P<0.01)，64.96 %(P<0.01)、44.18 %(P<0.01) 和47.8 %(P<0.05) 。見表2。

組別TNF-αIL-2IL-6IL-8正常組18.20±2.0320.17±3.8819.65±4.3221.33±5.38模型組129.75±6.32)91.43±4.052)83.63±6.812)73.54±4.562)Dex組52.15±5.692)4)24.27±3.424)30.87±6.151)4)37.92±4.541)3)PM組36.71±4.731)4)32.03±5.084)38.28±4.151)4)38.33±6.671)3)

3討論

ALI/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床常見的危重病，其發生和發展涉及多種病理生理過程的參與，其中炎癥反應是其重要表現之一〔1，9〕。LPS能通過啟動并放大機體的炎癥反應，造成中性粒細胞等炎癥細胞在肺部的積聚，是導致ALI的重要病因之一〔10〕。

本研究提示LPS處理后能啟動一系列信號轉導機制，激活多種炎癥細胞和效應細胞，釋放大量炎癥介質或細胞因子，PM對ALI小鼠的肺臟具有保護作用，其原因與抑制促炎因子的釋放有關。TNF-α對肺有強烈的毒性，異常表達的TNF-α與肺組織TNF-α受體結合，導致溶酶體受損，釋放大量酶類，直接損傷肺血管內皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞，引起肺部水腫和炎癥反應〔10，11〕。此外，TNF-α可誘導巨噬細胞合成并釋放IL-6、IL-8等促炎性細胞因子，使中性粒細胞變形、釋放過氧化物和溶酶體，加速炎癥反應，造成肺組織損傷〔10〕。作為炎癥因子IL-2能促進IFN-γ、IL-5、IL-6、TNF-β等炎癥因子的產生〔9，11〕。抑制肺臟炎癥因子發生，實現細胞保護作用研究已多有報道。如Dex能明顯減少TNF-α、IL-2和IL-6含量來降低LPS對肺泡的損傷〔11〕，維生素D3及其同系物能夠下調IL-8的表達來抑制急性肺炎和肺癌發生和發展〔12，13〕。

機體發病過程中，促炎細胞因子和抗炎細胞因子的相互作用介導著炎癥發生和發展，兩者之間的平衡有助于維持機體環境穩定。不難看出一個相對低的促炎性細胞因子或者一個相對高的抗炎因子表達，將有助于組織和器官損傷的修復；反之，則引起過度炎癥反應，損傷組織和器官〔14～16〕。因此，PM處理后抑制促炎因子TNF-α、 IL-2、IL-6和 IL-8的表達，有助于實現對小鼠肺臟損傷起到保護作用。

4參考文獻

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〔2014-03-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)