20(S)人參皂苷Rg3對糖尿病大鼠腎小管上皮細胞TGF-β1表達及凋亡的影響

20(S)人參皂苷Rg3對糖尿病大鼠腎小管上皮細胞TGF-β1表達及凋亡的影響

周彤張麗紅1辛穎1王桂俠

(吉林大學第一醫院，吉林長春130021)

摘要〔〕目的觀察20(S)人參皂苷Rg3對糖尿病大鼠腎小管上皮細胞轉化生長因子(TGF)-β1表達及凋亡的影響。方法利用高糖高脂喂養聯合腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。實驗分為正常對照組、糖尿病組和Rg3治療組。Rg3治療組以20 mg/kg體重每日灌胃給予人參皂苷Rg3。監測大鼠體重和血糖，于12 w結束實驗時處死大鼠，留取腎臟。用過碘酸雪夫(PAS)染色檢測各實驗組大鼠腎臟組織，觀察其形態學改變；免疫組化法檢測各實驗組大鼠腎臟組織中TGF-β1的表達；TUNEL染色觀察各實驗組大鼠腎臟組織凋亡的情況。結果通過PAS染色可以觀察到糖尿病組大鼠腎臟組織中腎小球毛細血管袢開放尚可，部分腎小球體積增大、囊腔裂隙變窄，腎小球系膜基質和系膜細胞彌漫性增生。Rg3治療組大鼠腎臟組織中腎小球形態接近正常。各實驗組大鼠腎臟組織中，TGF-β1均主要表達于腎小管上皮細胞，其中糖尿病組TGF-β1的表達增高，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；Rg3治療組TGF-β1的表達較糖尿病組明顯降低(P<0.05)，與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。TUNEL染色見糖尿病組腎小管上皮細胞大量凋亡，顯著高于對照組與Rg3治療組；Rg3治療組與正常對照組之間凋亡陽性率差異有統計學意義(P<0.05)。相關性分析結果顯示，腎小管上皮細胞TGF-β1的表達與細胞凋亡率呈正相關。結論20(S)人參皂苷Rg3顯著抑制了糖尿病大鼠腎小管上皮細胞的凋亡，這與其下調腎小管上皮細胞TGF-β1的表達相關，該研究證實了20(S)人參皂苷Rg3對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。

關鍵詞〔〕20(S)人參皂苷Rg3；糖尿??；轉化生長因子-β1；凋亡

中圖分類號〔〕R587〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：吉林省科技廳項目(20130101153JC)

通訊作者：王桂俠(1963-)，女，教授，博士生導師，主任醫師，主要從事糖尿病及各種內分泌代謝綜合征研究。

1吉林大學病理生物學教育部重點實驗室

第一作者：周彤(1990-)，女，在讀碩士，主要從事內分泌代謝疾病研究。

轉化生長因子(TGF)-β1是誘導腎小管間質纖維化的重要細胞因子之一〔1，2〕。腎小管間質纖維化是各種不同〔3〕病因所致慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的共同病理途徑。細胞凋亡參與了許多腎臟疾病的發生和修復過程。在腎臟發病過程中，腎小管上皮細胞凋亡可導致腎小管的萎縮及間質纖維化。研究表明阻止腎小管上皮細胞凋亡能夠有效地延緩腎臟纖維化的進程并減輕腎臟功能的損害〔4〕，而TGF-β1可誘導腎小管上皮細胞、足細胞凋亡〔5，6〕。20(S)人參皂苷Rg3(簡稱Rg3)具有抗腫瘤、抗氧化損傷及提高免疫力等作用〔7〕。最近研究顯示Rg3能夠降低糖尿病大鼠血糖和血肌酐，抑制腎臟炎癥反應〔8〕；減少糖尿病心肌TGF-β1的表達及心肌纖維化〔9〕。但其對糖尿病腎臟的保護作用是否與其抗凋亡作用及調節TGF-β1表達相關尚不清楚。本實驗通過觀察Rg3對糖尿病大鼠腎臟TGF-β1的表達以及對腎小管上皮細胞凋亡的影響，探討Rg3對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。

1材料和方法

1.1實驗動物及試劑30只4周齡雄性Wistar大鼠(190±20)g購于吉林大學基礎醫學院動物實驗中心，動物生產許可證：SCXK-(吉)2013-0001。20(S)人參皂甙-Rg3單體購買于吉林大學藥學院(純度為99%)。鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司。TGF-β1(bs-0103R)購于北京博奧森公司。SP超敏試劑盒(KIT-9710)、內源性生物素阻斷試劑盒(BLK-0001)和 DAB顯色劑(DAB-0031)均購于福州邁新公司。TUNEL試劑盒(11684817910)購于羅氏公司。

1.2大鼠糖尿病模型的建立30只4周齡雄性Wistar大鼠分籠飼養，溫度(22±2)℃，相對濕度55%±2%，大鼠自由飲水、進食。適應環境1 w后，10只用作正常對照(正常給水，正常飲食)，其余20只以高脂高糖飼料(基礎料66.6%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇0.4%、蛋黃粉3%)喂養4 w，按照35 mg/kg體重腹腔注射STZ(0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH4.4)1次，繼續高脂高糖飼料喂養1 w后，連續3 d尾部采血測定大鼠空腹血糖，若持續高于16.7 mmol/L視為造模成功。經鑒定符合糖尿病標準的大鼠共計18只，用于以下實驗。

1.3Rg3對糖尿病大鼠的干預實驗共分為3組：(1)正常對照組，10只正常成年大鼠，每天給予0.9%生理鹽水1 ml灌胃；(2)糖尿病組，9只上述成模糖尿病大鼠，每天給予0.9%生理鹽水1 ml灌胃；(3)Rg3治療組，9只上述成模糖尿病大鼠，每天給予Rg3灌胃干預，劑量為20 mg/kg。所有大鼠在喂養12 w后，禁食12 h，用3%戊巴比妥鈉2 ml腹腔注射麻醉固定，摘取腎臟，固定于10%中性緩沖甲醛中，以備組織學檢查。

1.4腎臟組織PAS染色、免疫組織化學染色及凋亡檢測取各組已固定的腎臟組織，經常規脫水、透明、石蠟包埋后，連續切片，厚度為2 μm。按照常規方法行PAS染色：石蠟切片脫蠟至水洗，1%過碘酸溶液室溫染色5 min，蒸餾水洗后Schiff氏液染色20 min，流水充分沖洗，蘇木精復染核，常規脫水及封片。顯微鏡下觀察腎臟的形態學改變，采用免疫組織化學SP法進行TGF-β1表達的檢測。染色方法：切片常規脫蠟至水洗，用檸檬酸鹽(pH6.0)進行熱修復，之后滴加內源性生物素阻斷試劑盒中的A、B各20份按SP試劑盒說明書進行。一抗的工作濃度為1∶300，用PBS代替一抗作為陰性對照。TGF-β1免疫組織化學染色以細胞質出現棕黃色顆粒為陽性表達。每張切片隨機取5個高倍視野，用IPP6.0軟件測定其積分光密度(IOD)值，進行統計學分析。利用原位末端標記法(TUNEL試劑盒)進行凋亡檢測，實驗步驟嚴格按說明書進行，用稀釋液代替反應液作為陰性對照。TUNEL染色以細胞核呈棕褐色為陽性表達。同樣每張切片隨機取5個高倍視野，用IPP6.0軟件分析凋亡率(即陽性細胞數占總細胞數的百分率)。

1.5統計學分析應用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1糖尿病模型的建立及實驗動物存活情況20只大鼠用高脂高糖飼料喂養4 w，按照35 mg/kg體重單次腹腔注射鏈脲佐菌素1 w后，符合糖尿病標準的大鼠共計18只，成模型率為90%。該18只糖尿病大鼠中，9只糖尿病組大鼠，在實驗的12 w內陸續死亡2只，結束實驗時存活7只；9只Rg3治療組大鼠，在實驗12 w內無死亡；10只正常對照組大鼠均健康存活。

2.2腎臟組織PAS染色結果對照組腎臟組織中見腎小球毛細血管袢開放好，無系膜增生和基底膜增厚等異常，糖尿病組見腎小球毛細血管袢開放尚可，部分腎小球體積增大、囊腔裂隙變窄，腎小球系膜基質和系膜細胞彌漫性增生，基底膜未見明顯增厚。Rg3治療組腎小球毛細血管袢開放較好，腎小球體積無明顯增大，腎小囊腔無明顯狹窄，腎小球系膜基質和系膜細胞輕度節段性增生，基底膜無顯著增厚。各組腎臟的腎小管、腎間質和小血管均未見明顯異常。見圖1。

2.3腎臟組織中TGF-β1的表達如圖2所示，各組腎臟組織中均見TGF-β1陽性表達，主要表達于腎小管上皮細胞。糖尿病組TGF-β1表達(8 740.19±4 711.74)明顯高于正常對照組(2 740.78±1 305.67)；Rg3治療組(4 315.59±1 227.24)顯著低于糖尿病組，高于正常對照組。

圖1　腎臟組織PAS染色(×400)

圖2　TGF-β1免疫組織化學染色(DAB，×400)

2.4腎臟組織的凋亡情況如圖3所示，在各組腎臟組織中，TUNEL染色陽性細胞主要見于腎小管上皮細胞。糖尿病組腎小管上皮細胞凋亡率(68.08±9.24)%顯著高于正常對照組(9.86±3.53)%；Rg3治療組(24.23±4.94)%低于糖尿病組，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3　腎臟組織凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.5TGF-β1表達與腎臟細胞凋亡發生的相關性將TGF-β1表達與凋亡率行相關性分析，其相關系數r=0.652，P<0.001，線性方程為y(凋亡率)=5.69E-005x+0.043，R2=0.425。說明TGF-β1的表達與腎小管上皮細胞凋亡率呈正相關。

3討論

TGF-β1是一種多功能細胞因子，在多種細胞和組織中參與控制細胞周期，調節細胞生長發育、細胞分化、基質形成、紅細胞生成、血管生長、化學趨化性、免疫功能以及介導細胞凋亡。近年來大量對梗阻性腎病分子機制的探討均發現TGF-β1 是介導腎臟細胞凋亡和腎纖維化發生最關鍵的細胞因子，在單側輸尿管結扎模型中給予TGF-β1 抗體能改善腎小管細胞凋亡〔10〕；體外試驗和體內試驗都已證實TGF-β1 在腎損傷后會導致腎小管上皮細胞和足細胞凋亡〔5，10，11〕，而腎小管上皮細胞凋亡可導致腎小管的萎縮，促進間質纖維化，最終導致慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰竭。目前認為TGF-β1 通過Smads通路和MAPK通路介導細胞凋亡〔12〕，因此，下調TGF-β1蛋白，降低腎小管上皮細胞凋亡，對臨床防治腎小管萎縮、減輕腎纖維化程度、延緩腎臟功能損害有著積極的意義。

人參皂苷Rg1可通過下調TGF-β1抑制擬衰老小鼠腎臟纖維化〔13〕。而人參皂甙Rg3能夠改善糖尿病腎病的病理改變，包括腎小球基底膜增厚、系膜基質增多、腎小球內炎細胞浸潤及腎間質的纖維化〔8〕。為達到更好的治療效果，Rg3的給藥劑量和給藥時機尚需進一步的研究。

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〔2015-04-22修回〕

(編輯徐杰)