辣椒素對類固醇糖尿病大鼠的影響及其作用機制

辣椒素對類固醇糖尿病大鼠的影響及其作用機制

周曉燕應長江1

(徐州醫學院形態學教學實驗中心，江蘇徐州221002)

摘要〔〕目的研究辣椒素對類固醇糖尿病(SDM)大鼠的影響及相關機制。方法SD大鼠隨機分為正常對照組(NC組)，SDM組和辣椒素組；檢測各組大鼠血糖，胰島素抵抗，血清中脂聯素和降鈣素基因相關肽(CGRP)的改變，胰島細胞凋亡率和胰腺組織細胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA變化。結果小劑量腹腔注射辣椒素明顯降低SDM大鼠血糖，抑制胰島素抵抗；增加血清脂聯素和CGRP的表達；下調SDM大鼠胰島細胞凋亡率和胰腺組織Caspase-3 mRNA的表達。結論辣椒素能改善SDM大鼠，與降低SDM大鼠血糖、抑制胰島素抵抗、增加血清脂聯素和CGRP的表達和抑制胰島細胞凋亡有關。

關鍵詞〔〕辣椒素；類固醇糖尿病；細胞凋亡；降鈣素相關蛋白；細胞凋亡蛋白酶-3

中圖分類號〔〕R587.2〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：徐州市科技項目(KC14SH094)

通訊作者：應長江(1980-)，男，主治醫師，碩士，主要從事內分泌并發癥研究。

1徐州醫學院附屬醫院

第一作者：周曉燕(1982-)，女，碩士，實驗師，主要從事糖尿病及其并發癥研究。

類固醇糖尿病(SDM)是一種特殊類型的糖尿病，是指由于內源性腎上腺糖皮質激素(GC)分泌增多，或外源性應用GC導致的繼發性糖尿病。超生理劑量的GC可以抗炎、抗過敏、抗毒素、免疫抑制，但GC的藥理特性是一把“雙刃劍”，在其發揮藥理作用的同時，也可產生一系列不良反應〔1〕。長期大劑量應用GC，使血糖升高導致的繼發性糖尿病是臨床上最常見的不良反應。辣椒素是從辣椒中提取出來的產生辣味的物質，是香草酰胺衍生物，具有消炎鎮痛，擴張血管，防治肥胖，保護胃黏膜以及抗腫瘤等作用〔2～4〕。研究顯示，辣椒素還能使胰島素分泌增加，降低血糖〔5〕，從而對糖尿病發揮一定程度的緩解和質量作用。但是關于辣椒素對SDM是否具有治療和緩解作用，目前少見報道。本實驗對SDM大鼠腹腔注射小劑量辣椒素，觀察其對SDM的影響，并探討其相關機制。

1材料與方法

1.1動物和試劑清潔級雄性健康SD大鼠，體重160～180 g，8周齡，由徐州醫學院實驗動物中心提供；辣椒素購自Sigma公司；地塞米松由徐州醫學院附屬醫院提供；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自中山金橋生物有限公司；TUNEL試劑盒購自Chemicon公司；PCR擴增試劑盒購自上海天根生物有限公司；PCR引物購自上海生物工程有限公司。

1.2模型制備和實驗分組40只大鼠隨機抽取8只為正常對照組(NC組)，其余32只造模為SDM大鼠：地塞米松腹腔注射(1 mg/kg，1次/d)連續3 w制備類固醇糖尿病大鼠模型，3 w后測空腹血糖(FPG)，大于13.8 mmol/L為標準篩選大鼠〔6〕19只，隨機分為類固醇糖尿病組(SDM組)8只和辣椒素組9只，死亡2只和血糖未達標的11只大鼠剔除，造模期NC組注射等0.9%生理鹽水；SDM組和辣椒素組于繼續使用等量的地塞米松腹腔注射，其中辣椒素組于地塞米松前30 min腹腔注射辣椒素(0.5 mg/kg)，連續3 w，NC組注射等量0.9%生理鹽水。

1.3血糖監測和標本留取各組大鼠每日尾靜脈采血監測血糖；3 w后，測量各組大鼠FPG和胰島素后，行心臟采血和快速分離胰腺手術；全血離心去上清，與-20℃冰箱凍存備用；胰腺組織一半于10%多聚甲醛中固定24 h，常規組織學計數制備石蠟切片，一半放入EP管-80℃冰箱凍存備用。

1.4胰島素抵抗利用胰島素抵抗指數(HOMA-IR)來衡量胰島素抵抗水平，HOMA-IR=空腹胰島素(mIU/L)×FPG(mmol/L)/22.5〔7〕。

1.5血清脂聯素水平和降鈣素基因相關肽(CGRP)均采用ELISA法，嚴格按照試劑盒的說明書操作，采用典型的競爭法酶聯免疫吸附測定大鼠血清脂聯素和CGRP，試劑盒及待測標本放置室溫下平衡30 min后進行。

1.6胰島細胞凋亡率采用TUNEL法，嚴格按照試劑盒說明書操作，中性樹脂封片。光鏡下觀察細胞體積縮小成團或形成凋亡小體、胞核呈棕黃色的細胞即為陽性。用圖像分析儀對陽性細胞數行半定量分析，以高倍視野下陽性細胞數占細胞總數的百分比作為分析指標。

1.7血清胰腺組織細胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表達采用RT-PCR法，嚴格按照試劑盒說明書的步驟操作，配置50 μl的反應體系，并設置反應條件(表1)。電泳后經凝膠成像系統分析成像，各組目的片段分別于相應的β-actin片段的相對灰度值比值作為Caspase-3 mRNA的相對量。

表1引物序列和RT-PCR反應條件

基因引物序列片段長度(bp)退火溫度循環數Caspase-3正義5'-CTGGACTGCGGTATTGAG-3'10257℃32反義5'-GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3'β-actin正義5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3'21755℃35反義5'-TTGATGTCACGCACGATTTC-3'

2結果

2.1辣椒素對SDM大鼠血糖和胰島素抵抗的影響SDM組FPG高于NC組(P<0.05)，辣椒素組FPG低于SDM組(P<0.05)；SDM組HOMA-IR高于NC組(P<0.05)，辣椒素組HOMA-IR低于SDM組(P<0.05)(表2)。

2.2辣椒素對SDM大鼠血清脂聯素和CGRP的影響SDM組血清脂聯素和CGRP低于NC組(P<0.05)，辣椒素組血清中脂聯素和CGRP高于SDM組(表2)。

2.3辣椒素對SDM大鼠胰島細胞凋亡率和Caspase-3 mRNA的影響SDM組胰島細胞凋亡率高于NC組(P<0.05)，辣椒素組胰島細胞凋亡率低于SDM組(P<0.05)(表2)；SDM組Caspase-3 mRNA表達(2.11±0.019)表達高于NC組(0.65±0.013)，辣椒素組Caspase-3 mRNA表達(1.61±0.016)低于SDM組(P<0.05)，但高于NC組(P<0.05)(圖1)。

組別nFPG(mmol/L)HOMA-IR脂聯素(ng/L)CGRP(ng/L)凋亡率(%)NC組85.16±2.233.98±0.760.98±0.27237.46±79.1215.64±6.41SDM組824.27±6.091)42.16±11.521)0.36±0.181)98.69±44.811)42.80±11.631)辣椒素組913.01±4.741)2)19.24±6.011)2)0.69±0.301)2)189.21±50.071)2)29.99±7.351)2)

與NC組比較：1)P<0.05；與SDM組比較：2)P<0.05

圖1　辣椒素對SDM大鼠胰腺組織Caspase-3 mRNA 表達的影響

3討論

SDM屬于繼發性糖尿病范疇，其發生機制主要是糖皮質激素導致肝糖原異生增加，骨骼肌細胞葡萄糖攝取和糖原合成減少產生胰島素抵抗〔8〕。雖然這種激素所致的SDM發生率為10%～40%〔9〕，并且待其減量或者停藥后糖代謝異常多數能恢復正常，但是短暫的高血糖也會對人體的免疫系統產生有害的影響。糖皮質激素不僅可以使胰島細胞的胰島素分泌功能受損，也可以促進凋亡相關因子的表達，引起胰島細胞的凋亡〔10,11〕，但其分子機制還不是十分清楚。

以往對于SDM治療，首先采用飲食控制和加強運動，必要時加用胰島素治療。但是單純飲食控制效果不好，有些病人(如腎臟疾病用糖皮質激素治療)治療誘導期不適合運動，所以胰島素和降糖藥物治療常作為SDM首選。但對于既往無糖尿病的患者往往不易接受，而且全程必須監測血糖，及時調整用量，以防患者發生低血糖，同時藥物存在的副作用(如低血糖)也給患者帶來很多不便。尋求能被患者接受，并且副作用小的藥物，已成為臨床上防治SDM一個研究熱點。

辣椒素可以通過結合機體內辣椒素受體，促進組織和血清中的CGRP釋放，使細胞內鈣離子濃度升高，引起神經元及其纖維釋放多種神經肽，對機體發揮保護作用。辣椒素能減低血糖，提高血漿胰島素水平和葡萄糖耐量〔12〕，同時，辣椒素通過上調組織和血清中CGRP的水平，抑制凋亡信號通路和下調相關蛋白，抑制血糖升高引起組織細胞的凋亡〔13〕。但是辣椒素降低血糖和緩解糖尿病并發癥的研究尚處于摸索階段，而且相關研究只限于動物實驗。

本實驗研究顯示，股靜脈給予小劑量辣椒素能降低SDM大鼠血糖和HOMA-IR，提高血清中脂聯素和CGRP的水平，下調胰島細胞Caspase-3 mRNA的表達，抑制胰島細胞凋亡，對SDM大鼠發揮保護作用。綜上，辣椒素通過降低SDM大鼠血糖和胰島素抵抗，增加SDM大鼠血清中脂聯素和CGRP的水平，下調胰島細胞的Caspase-3 mRNA表達而抑制胰島細胞凋亡，從而減輕大鼠SDM。但是對其效應產生的具體機制和存在相關的信號通路，有待進一步探討，以便為臨床上防治SDM提供一定的理論依據。

4參考文獻

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〔2014-12-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)