輕度認(rèn)知功能障礙患者尿液生物標(biāo)志物

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輕度認(rèn)知功能障礙患者尿液生物標(biāo)志物

李乃靜李偉1何平

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科，遼寧沈陽(yáng)110004)

摘要〔〕目的探討輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)患者尿液中潛在的生物標(biāo)志物。方法通過(guò)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和代謝組學(xué)的方法，考查MCI患者和正常老年人尿液中代謝產(chǎn)物的擾動(dòng)。對(duì)于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用所產(chǎn)生的色譜圖，進(jìn)行主成分分析顯示出疾病組和正常組之間的代謝物的變化。結(jié)果MCI患者的鞘氨醇類相對(duì)于正常組變化明顯，5個(gè)潛在的與MCI相關(guān)的生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)。結(jié)論MCI患者的代謝物譜發(fā)生了明顯改變，這可以為MCI的診斷提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞〔〕輕度認(rèn)知功能障礙;尿液;標(biāo)志物

中圖分類號(hào)〔〕R749.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81203002)；沈陽(yáng)市科技局課題(No.F12-193-9-22)

1沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥分教研室

第一作者：李乃靜(1972-)，女，博士，副教授，主要從事老年病研究。

Urine metabolic profiling of mild cognitive impairment

LI Nai-Jing,LI Wei,HE Ping

Department of Gerontology,Shengjing Affiliated Hospital,China Medical University,Shengyang 110004,Liaoning,China

Abstract【】ObjectiveTo explore potential biomarkers in urine for mild cognitive impairment(MCI).MethodsUrine metabolic perturbations between MCI and healthy old person were investigated by using ultra performance liquid chromatography/mass spectrometry(UPLC/MS)and metabonomics approach.The principal component analysis(PCA)of UPLC/MS spectra showed that metabolic changes between two groups.ResultsThe PCA of UPLC/MS spectra showed that metabolic changes observed between MCI and control were clear.Five potential biomarkers in correlation with the extent of MCI were found.ConclusionsThe perturbation of phospholipids metabolism of MCI diseases may be important for clinical diagnosis and treatment.

【Key words】Mild cognitive impairment;Uine;Biomarkers

認(rèn)知功能障礙性疾病主要包括阿爾茨海默病(AD)和輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)。在美國(guó)認(rèn)知功能障礙性疾病每年至少造成10萬(wàn)人死亡，僅次于心臟病、癌癥、腦卒中〔1〕。但目前尚不能對(duì)認(rèn)知功能障礙性疾病早期診斷，更無(wú)有效的治療措施。代謝組學(xué)是研究外源性物質(zhì)對(duì)生物體產(chǎn)生的整體效應(yīng)，并以生物體內(nèi)物質(zhì)分子的整體作為對(duì)象,通過(guò)核磁共振(NMR)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)等高通量、高分辨、高靈敏度的現(xiàn)代儀器分析手段，定性或定量研究生物體液中的代謝產(chǎn)物，研究藥物對(duì)機(jī)體所形成代謝組的系統(tǒng)作用〔2,3〕。本研究采用代謝組學(xué)的方法，確定MCI患者的生物標(biāo)志物。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)儀器與試劑液相系統(tǒng) Waters AcquityTMUltra Performance Liquid Chromatography(UPLC)system，美國(guó) Waters 公司；質(zhì)譜儀 Micromass Quattro microTMAPI 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀 ，Waters 公司；高效液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-ESI- QTOF- MS)，德國(guó) Bruker 公司；臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16C)，上海安亭科學(xué)儀器廠；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(TGL-16)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；振蕩器CAY-1型液體快速混合器，北京長(zhǎng)安儀器廠；微量取樣器(200 μl) Proline單道可調(diào)移液器，上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)美國(guó) Fisher公司。

1.2試驗(yàn)對(duì)象本研究選取中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院MCI患者(MCI組)和健康的老年志愿者(對(duì)照組)各20例，MCI組男10例，女10例，平均年齡(70±11)歲，體重指數(shù)(BMI)(26.5±2.2)kg/m2；對(duì)照組男10例，女10例，平均年齡(24.2±1.9)歲，BMI(24.2±1.9)kg/m2。本研究遵照《赫爾辛基宣言》的原則實(shí)施。健康老年受試者沒(méi)有神經(jīng)和認(rèn)知的疾病。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1尿樣采集與預(yù)處理采取MCI患者和健康的老年志愿者的晨尿，約10 ml/h，加疊氮化鈉作為防腐劑，3 500 r/min離心10 min。取200 μl尿樣加入1.5 ml EP管中,加入400 μl甲醇沉淀蛋白，在4℃的低溫離心機(jī)中，15 000 r/min離心10 min,上清液轉(zhuǎn)移至另一EP管中，保持30℃恒溫，在N2氣流下吹干，用100 μl甲醇復(fù)溶，復(fù)溶后轉(zhuǎn)移至2 ml的進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣10 μl，用于UPLC-MS 分析。

1.3.2UPLC-MS代謝產(chǎn)物的圖譜采集代謝組學(xué)研究需要對(duì)生物樣品預(yù)處理，本實(shí)驗(yàn)中采取甲醇沉淀尿液中蛋白。質(zhì)譜檢測(cè)器采用正離子方式檢測(cè)。MCI患者和健康的老年志愿者的尿樣總離子流(TIC)色譜圖見(jiàn)圖1。

1.4UPLC-MS測(cè)定的方法學(xué)確證在分析實(shí)驗(yàn)樣品之前，需要進(jìn)行方法確證。考查儀器的精密度，日內(nèi)穩(wěn)定性，方法的重復(fù)性。計(jì)算峰強(qiáng)度和峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSDs)。 儀器精密度：相同的樣品連續(xù)進(jìn)5針，保留時(shí)間的RSDs從0.05%～0.45%，峰強(qiáng)度的RSD從2.5%～8.5%。處理后樣品穩(wěn)定性，通過(guò)分析一份樣品處理后，放置于保持在4℃的自動(dòng)進(jìn)樣器中，考察0，4，8，12，24 h的穩(wěn)定性,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一針，結(jié)果顯示峰強(qiáng)度的 RSDs 從2.6%～8.5% ，保留時(shí)間的RSDs從0.05%～0.46%，表明方法精密度良好。

圖1　兩組研究對(duì)象尿樣TIC色譜圖

1.5數(shù)據(jù)分析和生物標(biāo)志物的鑒定將原始圖譜導(dǎo)入 Markerlynx 軟件進(jìn)行分析處理，設(shè)置主要分析參數(shù)，進(jìn)行主成分分析(PCA)。主要參數(shù)設(shè)置如下：質(zhì)譜的質(zhì)量數(shù)誤差：0.01 D；噪音消除水平：10.0；初始和結(jié)束保留時(shí)間分別為0和20 min；低，高分子量分別設(shè)置成100，900 amu。從全掃描質(zhì)譜圖中來(lái)分析生物標(biāo)志物并且作圖。由碰撞誘導(dǎo)的裂解(CID)方式可以得到這些潛在生物標(biāo)記物的裂解譜圖。一些標(biāo)記物通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)比色譜峰保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜碎片特征。這些代謝物的全掃描質(zhì)譜圖，通過(guò)查找可利用的生物化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，例如KEGG，METLIN等得到解釋。同時(shí),一些生物標(biāo)志物通過(guò)在相同液相條件下，對(duì)比在Bruker飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-QTOF-MS)上的保留時(shí)間和精確分子量來(lái)確認(rèn)。

2結(jié)果

通過(guò) PCA 分析，鑒定出了5個(gè)標(biāo)志物。在正離子模式下，保留時(shí)間(min)和質(zhì)荷比(m/z)成對(duì)出現(xiàn):9.4_274.3，8.2_246.3，9.5_318.3，12.0_330.4，10.8_346.4。通過(guò)在Waters UPLC/MS/MS儀器上分析分子量和裂解碎片之后，進(jìn)一步分析了來(lái)自Bruker ESI-QTOF-MS的精確分子量數(shù)據(jù)和二級(jí)裂解碎片。通過(guò)比較兩者的一致性，查找 HMDB 和 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，這一類化合物被分別鑒定為274.3：C16 DHS，246.3：C14 DHS，318.3：C18 PHS，330.4:C20 DHS，346.4:C20 PHS。其對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間與m/z的總結(jié)見(jiàn)表1。MCI組鑒定出的5個(gè)標(biāo)志物的含量明顯低于對(duì)照組，標(biāo)志物含量的相對(duì)變化趨勢(shì)見(jiàn)表2。

表1MCI組生物標(biāo)記物代謝組學(xué)特征

保留時(shí)間(min)m/z代謝物精確分子量測(cè)定分子量MCIvs.對(duì)照組9.4274.3C16DHS2274.2746274.2742(1.6ppm)↓8.2246.3C14DHS2246.2433246.2427(2.6ppm)↓9.5318.3C18PHS2318.3008318.3002(2.0ppm)↓12.0330.4C20DHS2330.3372330.3362(3.1ppm)↓10.8346.4C20PHS2346.3321346.3322(0.2ppm)↓

表2MCI組和對(duì)照組峰強(qiáng)度比較

指標(biāo)對(duì)照組MCI組C14DHS210.067.401)C16DHS230.7928.501)C18PHS219.3714.601)C20DHS214.8010.601)C20PHS29.277.001)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

3討論

隨著人類老齡化社會(huì)進(jìn)程的加快，老年人認(rèn)知功能障礙性疾病逐年增多，正確診斷和識(shí)別MCI，對(duì)早期干預(yù)、防止癡呆的發(fā)生有重要意義。據(jù)報(bào)道MCI性疾病在發(fā)病早期代謝物中的一些生物學(xué)標(biāo)志物的改變?cè)缬谂R床癥狀的出現(xiàn)〔4〕。生物學(xué)標(biāo)志物存在于腦脊液、血液和尿液等標(biāo)本中，許多學(xué)者研究了腦脊液內(nèi)可能的標(biāo)志物，主要集中在Aβ蛋白、總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白，檢測(cè)手段多為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和蛋白組學(xué)技術(shù)〔5，6〕，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)來(lái)探索認(rèn)知功能障礙性疾病生物標(biāo)志物的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。代謝組學(xué)是對(duì)限定條件下的特定生物樣品中所有代謝產(chǎn)物的定性定量分析，多應(yīng)用于植物和微生物領(lǐng)域研究細(xì)胞的代謝組學(xué)。代謝組學(xué)技術(shù)能夠?qū)⒒蚝偷鞍踪|(zhì)表達(dá)的微小變化在代謝物上放大，從而使檢測(cè)更為容易，研究的樣品主要包括尿液、血液、唾液以及細(xì)胞或組織的提取液等。目前對(duì)認(rèn)知功能障礙患者尿液代謝組學(xué)的研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MCI患者尿液中確定的生物標(biāo)志物為5種神經(jīng)鞘氨醇類化合物。鞘脂類及其衍生物鞘氨醇、 神經(jīng)酰胺和雙氫鞘氨醇,被認(rèn)為是重要的信號(hào)分子，介導(dǎo)了許多生物學(xué)功能，例如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、老化和程序性死亡〔7〕。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)人成纖維細(xì)胞進(jìn)入衰老階段時(shí),其內(nèi)源性神經(jīng)酰胺水平特異性顯著升高。同時(shí)這些細(xì)胞中的中性鞘磷脂酶的活性也提高〔8〕。在細(xì)胞中加入外源性神經(jīng)酰胺可誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生與衰老細(xì)胞類似的形態(tài)學(xué)改變。 因此,神經(jīng)酰胺的形成可代表著一條特殊的細(xì)胞老化信號(hào)途徑。由此鞘氨醇類物質(zhì)的變化可作為AD的生物標(biāo)志物。近年來(lái),利用具有細(xì)胞毒作用的藥物尤其是天然藥物甚至是膳食干預(yù)的途徑對(duì)老年癡呆的防治,已經(jīng)愈來(lái)愈受到人們的重視,給大鼠食用神經(jīng)酰胺或者其衍生物，對(duì)于大鼠在認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶方面的腦部功能均有有利的作用〔9〕。隨著鞘脂質(zhì)及其代謝物與細(xì)胞凋亡相互關(guān)系究的明確及其相關(guān)理論的建立,利用富含鞘脂類物質(zhì)的食物及其強(qiáng)化食品或直接以藥劑的形式進(jìn)行預(yù)防和治療相關(guān)疾病必將成為可能。

本實(shí)驗(yàn)將代謝組學(xué)的方法運(yùn)用于認(rèn)知功能障礙性疾病的研究，確定輕度認(rèn)知功能障礙代謝物中特異、可靠的生物標(biāo)志物；明確認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度與生物標(biāo)記物的含量的相關(guān)性。總結(jié)認(rèn)知功能障礙性疾病內(nèi)源性代謝物變化的規(guī)律，為認(rèn)知功能障礙性疾病的特異性診斷提供科學(xué)支撐和新的理論依據(jù)，并為代謝組學(xué)的臨床應(yīng)用研究探索新思路。

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〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

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