三七三醇皂苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠微管相關(guān)蛋白2、膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達的影響

三七三醇皂苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠微管相關(guān)蛋白2、膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達的影響

張利軍白宇侯育青程記偉陳黎佶

(上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,上海200062)

摘要〔〕目的了解局灶性腦缺血再灌注后梗死區(qū)周圍微管相關(guān)蛋白(MPA)2、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達的動態(tài)變化以及三七三醇皂苷對其表達的影響。方法采用改良的線栓法制備大腦中動脈阻塞0.45 h后，不同再灌注時間(1、7、14、21、28 d) ，大鼠短暫局灶性腦缺血模型。應用免疫雙標法觀察再灌注損傷后1、7、14、21、28 d Brdu、Brdu/MPA2 、Brdu/GFAP表達及三七三醇皂苷對其影響。結(jié)果腦缺血再灌注后14 d Brdu表達水平達到峰值,至再灌注28 d Brdu表達水平已明顯回落,但仍較正常水平高。再灌注7、14、21 d,三七三醇皂苷組Brdu/GFAP陽性細胞比例高于模型組(P<0.05)。三七三醇皂苷組Brdu/MPA2陽性細胞水平于整個實驗過程中均較相同時間段對照組增多，但都無顯著差異(P>0.05) 。結(jié)論腦缺血再灌注后神經(jīng)干細胞增殖水平增高，而三七三醇皂苷治療可能加速了神經(jīng)干細胞的增殖，并可能使增殖的神經(jīng)干細胞更多向膠質(zhì)細胞分化。

關(guān)鍵詞〔〕三七三醇皂苷; 腦缺血再灌注; Brdu;微管相關(guān)蛋白(MPA)2;膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)

中圖分類號〔〕R743.3〔

基金項目：上海市教委基金資助項目(No.08CZ039)

第一作者：張利軍(1971-)，男，碩士，碩士生導師，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病研究。

三七三醇皂苷(PTS) 主要活性成分人參三醇皂苷Rg1 的含量達60%以上,Rg1、R1、Re 三者的含量約達80%。在研究三七中人參三醇皂苷對腦缺血的保護作用時發(fā)現(xiàn)PTS可通過抑制腦血管通透性的增加，減輕腦水腫，使得神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、小血管及毛細血管周圍間隙輕度增寬，神經(jīng)細胞腫脹明顯減輕，有利于神經(jīng)細胞的修復〔1〕。本實驗觀察不同時期梗死區(qū)周圍皮層5-溴脫氧尿嘧(Brdu)、Brdu/微管相關(guān)蛋白(MPA)2、Brdu/膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達情況，識別缺血再灌注損傷后增殖細胞的來源和分化情況及PTS對其的影響。

1材料與方法

1.1動物模型制備及分組健康雄性SD 大鼠,體重250～300 g ,由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，采用改良Longa線栓法阻塞大鼠大腦中動脈，建立急性局部腦缺血模型。45 min后，將尼龍線輕柔拉回致頸外動脈處，即為再灌注開始。將尼龍線僅留在頸內(nèi)動脈而不入顱，45 min后，將尼龍線拉回致頸外動脈處，為假手術(shù)組。動物隨機分為:①PTS (成都華神集團股份有限公司制藥廠)組(PTS 50 mg·kg-1·d-1);②模型組(0.9%氯化鈉1 mg·kg-1·d-1)③假手術(shù)組。每組又分造模后第1、7、14、21、28天共5個時間組,其中PTS組、模型組每個時間組各5 只,假手術(shù)組各4只。

1.2PTS及Brdu給藥PTS 組大鼠于再灌注術(shù)后按50 mg/kg 腹腔注射給藥,每天1次,直至取材;模型組大鼠,藥物由生理鹽水代替; 各組大鼠達規(guī)定時限前1 d,腹腔注射Brdu(50 mg/kg,Sigma公司)2次,間隔3 h ,最后1 次注射后24 h 大鼠在麻醉下,斷頭取腦。

1.3免疫雙標染色嚴格按照操作步驟固定、取材、切片、封片，-20℃保存待共聚焦觀察各組皮層Brdu、Brdu+MPA2、Brdu+GFAP陽性表達。

1.4圖像分析切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)(10×10) 下,于梗死區(qū)周圍皮層隨機選3個視野,測量方式選全視場測量,使用上海求為生物科技有限公司MIQAS醫(yī)學圖像免疫組化定量分析軟件自動分析檢測出熒光圖像中陽性區(qū)域面積和陽性比率。

1.5統(tǒng)計學方法采用PEMS軟件進行方差分析,兩兩比較用SNK-q檢驗。

2結(jié)果

2.1腦缺血再灌注后梗死區(qū)周圍皮層Brdu陽性細胞比較假手術(shù)組Brdu 陽性標記物為圓形、卵圓形或橢圓形、呈亮藍色、境界清晰，主要分布在室管膜、室管膜下區(qū)及海馬齒狀回且數(shù)目少、分散。PTS組及模型組缺血再灌注1 d,Brdu陽性細胞開始增多,于缺血中心區(qū)及缺血周邊皮層、海馬呈散落分布，PTS組與模型組間無明顯差異(P>0.05)。PTS組與模型組缺血周邊皮層于再灌注7、14 d,均可見Brdu陽性細胞數(shù)目急劇增多并達高峰,至21 d時增長幅度下降,尤以模型組明顯。在缺血再灌注第7、14、21、28天時,PTS組與模型組間Brdu陽性細胞數(shù)有顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1　腦缺血再灌注后梗死區(qū)周圍皮層Brdu陽性細胞變化

與模型組比較：1)P<0.05；下表同

2.2免疫雙標染色觀察GFAP、MPA2表達免疫雙標染色: 整個實驗過程中假手術(shù)組僅有少量Brdu/GFAP陽性標記細胞，模型組和PTS 組梗死區(qū)周圍皮層可見較多Brdu/GFAP陽性標記細胞分布,Brdu/GFAP陽性為藍色加紅色熒光(圖1)。再灌注1 d時模型組和PTS組即可見梗死區(qū)周圍皮層Brdu/GFAP陽性細胞,明顯多于假手術(shù)組(P<0.05)，但模型組和PTS組相比無明顯差異(P>0.05)。再灌注7 d時,Brdu/GFAP陽性細胞明顯增多,再灌注14 d時Brdu/GFAP陽性細胞數(shù)目達頂峰(圖1),圍繞梗死區(qū)皮層散在分布，且模型組和PTS 組相比Brdu/GFAP陽性細胞差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此后，隨Brdu陽性細胞數(shù)目逐漸回落,Brdu/GFAP陽性細胞數(shù)目亦有所減少,至再灌注28 d時,Brdu/GFAP陽性細胞數(shù)已明顯回落。 在整個實驗過程中，盡管PTS組在缺血再灌注第1、7、14、21、28天各時間點Brdu/MPA2陽性細胞數(shù)均比模型組多，且有隨再灌注時間延長逐漸增趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

圖1　PTS組及模型組再灌注14 d梗死區(qū)周圍Brdu/GFAP 陽性表達(免疫雙標法，×100)

組別nBrdu/GFAP1d7d14d21d28dBrdu/MPA21d7d14d21d28dPTS組52.2465.8488.221)7.491)3.9982.1982.8083.7563.3183.192模型組52.0524.6126.4065.773.3221.7442.312.9442.6542.742假手術(shù)組40.82751.051.06750.8650.86251.00511.2551.00251.0475

3討論

腦缺血損傷時損傷側(cè)的海馬、室管膜、大腦皮質(zhì)和健側(cè)海馬區(qū)域的神經(jīng)干細胞(NSC)增殖、遷移和分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，以試圖代償和修復損傷的神經(jīng)組織〔2,3〕。Brdu陽性細胞可被看作具有增殖活性的細胞〔4〕。但由于腦梗死所致的血腦屏障破壞及動物模型制作過程中的手術(shù)損傷刺激均可以引起腦內(nèi)炎性細胞增殖,因此腦梗死后增殖的細胞既有炎性細胞也有神經(jīng)前體細胞。NSC具有自我復制和多向分化(神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞)的潛能〔5〕，MPA2在成熟的神經(jīng)元中有較高的表達水平，近年來被認為是神經(jīng)元身份鑒定的特異性抗原之一。 GFAP是星形膠質(zhì)細胞特異性抗原標志。因此應用Brdu/MPA2、Brdu/GFAP 免疫雙標記法可確定增殖細胞的來源及神經(jīng)干/前體細胞的數(shù)目和分布情況。

研究顯示，PTS可減少缺血再灌注大鼠腦組織Nogo-A mRNA和蛋白表達、減少Caspase-3表達、抑制腦缺血再灌注后炎癥因子分泌及細胞凋亡，從而起到腦保護作用〔6～8〕。已有研究顯示反應性星形膠質(zhì)細胞增生與維持腦損傷后內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、促進血管再生、神經(jīng)生長、有利于可塑性修復作用發(fā)生〔9〕,同時,活性星形膠質(zhì)細胞釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子,是促進神經(jīng)細胞再生的最有效的因子,作為神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)信號可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞構(gòu)筑、存活及可塑性變化,誘導合成增加,提供軸索合成基質(zhì),參與內(nèi)源性修復,以促進中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)軸索的生長和存活,在神經(jīng)細胞再生過程中起相當重要的作用。室管膜下區(qū)的NSC正常情況下是相對靜止的,誘導或刺激其發(fā)生增殖、分化的因素中,基礎成纖維細胞的作用尤為令人注目,基礎成纖維細胞作為刺激NSC 增殖的重要的絲裂原,可以誘導相對靜止的神經(jīng)干細胞進入細胞周期，若將基礎成纖維細胞注入成年鼠的側(cè)腦室內(nèi),則可促進NSC增殖及新生細胞數(shù)量的增加〔10,11〕。本研究推測腦缺血再灌注后神經(jīng)元再生比較困難，而PTS治療可能加速了NSC的增殖，并可能使增值的NSC更多向膠質(zhì)細胞分化，其機制有待進一步研究。另外在缺血中心區(qū)亦有散在分布的增殖細胞,但此類細胞并無Brdu/MPA2、Brdu/GFAP陽性標記,推測可能是侵入的炎性細胞。

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〔2013-09-13修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)