針刺聯(lián)合中藥對(duì)糖尿病模型大鼠胰島的保護(hù)作用

針刺聯(lián)合中藥對(duì)糖尿病模型大鼠胰島的保護(hù)作用

胥冰劉娟田磊馬曉軍

(陜西中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系免疫及檢驗(yàn)教研室，陜西咸陽(yáng)712046)

摘要〔〕目的探討針刺聯(lián)合中藥對(duì)糖尿病大鼠胰島的保護(hù)作用及機(jī)制。方法健康老年SD大鼠50只，雌雄各半。隨機(jī)分為：空白組；模型組；針刺組；中藥組；針刺+中藥組(n=10)。除空白組外，其余各組大鼠經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(45 mg/kg，1次)，72 h后經(jīng)測(cè)定血糖確認(rèn)模型復(fù)制成功。針刺組取肺俞、三陰交等兩組穴位隔天交替針刺8個(gè)療程(6 d為一療程)；中藥組給予白芍甘草湯灌胃(10 ml/kg，1次/d)7 w。針刺+中藥組在針刺同時(shí)聯(lián)合白芍甘草湯灌胃。各組動(dòng)物于7 w后麻醉處死，檢測(cè)血糖、血胰島素水平及血清一氧化氧(NO)水平，取胰腺利用RT-PCR及免疫組化檢測(cè)大鼠胰腺組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠血糖水平明顯升高，血中胰島素的水平明顯降低、血清一氧化氮(NO)水平明顯升高，胰腺iNOS的表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，針刺+中藥組血糖的水平明顯降低，血胰島素水平明顯升高、NO水平明顯降低、胰腺iNOS的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；針刺組或中藥組大鼠雖然血糖水平降低，血胰島素水平升高、NO水平降低、胰腺iNOS的表達(dá)降低，但與模型組無(wú)差異(P>0.05)。結(jié)論針刺聯(lián)合中藥能有效促進(jìn)胰島素分泌，發(fā)揮降血糖的功效，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)iNOS的表達(dá)從而降低血清中NO水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕針刺；白芍甘草；一氧化氮；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；糖尿病

中圖分類號(hào)〔〕R245.3〔

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目資助(No.07k225)

通訊作者：馬曉軍(1964-)，男，副教授，主要從事生物化學(xué)分子生物學(xué)教學(xué)研究。

第一作者：胥冰(1968-)，女，碩士，副教授，主要從事中醫(yī)藥免疫學(xué)教學(xué)研究。

糖尿病表現(xiàn)為血糖升高，胰島素的水平降低，其發(fā)病機(jī)制可能和胰島β細(xì)胞的凋亡相關(guān)〔1～4〕。糖尿病在中醫(yī)稱之為消渴，古代醫(yī)家論述消渴病機(jī)時(shí)大多以陰虛燥熱立論，陰虛為本，燥熱為標(biāo)〔5〕。因此中醫(yī)治療糖尿病多采用滋陰清熱、生津、滋腎等法。白芍苦酸微寒，養(yǎng)血斂陰，甘草舒筋活絡(luò)，酸甘化陰，二藥合用共奏養(yǎng)陰生津，潤(rùn)燥清熱之效〔6〕。近來(lái)采用毫針刺，電針、艾灸、穴位注射等針灸方法治療糖尿病也取得了較好的療效〔7〕。但是白芍、甘草或者針刺治療糖尿病的機(jī)制尚未闡明，它們是否通過(guò)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)從而降低胰腺組織中氧化氮(NO)水平，抑制胰島細(xì)胞的凋亡對(duì)胰島細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用目前尚不清楚。本研究觀察針刺、中藥及針刺聯(lián)合中藥對(duì)糖尿病大鼠胰島細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器鏈脲佐菌素(STZ)，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司(D130)；葡萄糖測(cè)定試劑盒(GOD-PAP法)、NO測(cè)試盒(硝酸還原酶法)購(gòu)于上海榮盛生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑為天根公司產(chǎn)品；白芍和甘草均選用生藥，將二藥兩次煎煮后的藥液分別過(guò)濾，合并濾液，濃縮制成100%(W/V)濃度，相當(dāng)于1 g/ml生藥置4℃保存?zhèn)溆谩?300熒光定量PCR儀(ABI公司)、蔡氏顯微鏡(德國(guó)產(chǎn))、723分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(日立)。

1.2動(dòng)物分組、 模型復(fù)制健康SD大鼠雌雄各半50只，20個(gè)月齡，體重(400±50)g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(陜)2007-001。各組小鼠分籠飼養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食，不禁水，室溫飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為五組(n=10)：空白組；模型組；針灸組；中藥組；針灸+中藥組。除空白組外，其余各組大鼠經(jīng)腹腔注射STZ(45 mg/kg，1次)〔7〕，72 h后，測(cè)定大鼠空腹血糖，選取血糖≥11.1 mmol/L的大鼠為造模成功。

1.3治療方案空白組，普通飼料喂養(yǎng)8 w后，一次性腹腔注射pH4.2，0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。針灸組取①肺俞、胰俞、脾俞及腎俞；②關(guān)元、中脘、三陰交、足三里。第一組均向脊柱方向斜刺入0.5～0.8 cm，第二組均垂直進(jìn)針0.2～0.5 cm，至針下沉緊后，行捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法(小幅度快速捻轉(zhuǎn)10 s)，留針30 min，每隔10 min行針一次，1次/d，出針前再行補(bǔ)法(手法同前)〔8〕；第1天針刺穴位，第2天用②穴位治療，兩組穴位隔天交替針刺8個(gè)療程(6 d為一療程)；中藥組給予白芍甘草湯灌胃(10 ml/kg，1次/d)7 w。針灸+中藥組在針灸同時(shí)聯(lián)合白芍甘草湯灌胃。

1.4標(biāo)本采集與檢測(cè)各組動(dòng)物于7 w后麻醉處死，于空腹12 h后將各組大鼠用10%戊巴比妥麻醉，心臟采血，分離血清；完整摘除胰腺置于10%中性甲醛溶液浸泡固定。采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖(FPG)；采用放射免疫法測(cè)定空腹胰島素(FINS)含量，剖腹取取胰腺組織，測(cè)定iNOS蛋白、mRNA及NO含量表達(dá)。

1.4.1胰島組織的病理學(xué)變化一部分胰腺組織經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色觀察胰島病理學(xué)改變。

1.4.2胰腺組織NO含量取胰腺組織，4℃生理鹽水洗凈殘血，濾紙拭千、稱重，用冷0.85%生理鹽水按1∶10(W/V)制成10%組織勻漿以測(cè)NO含量(硝酸還原酶法)。

1.4.3胰腺組織iNOS mRNA表達(dá)應(yīng)用PrimerExpress軟件(PE Biosystems)設(shè)計(jì)基因特異性PCR引物序列iNOS特異性引物上游序列為:5′-ATCCCGAAACGCTACACTT -3′，下游:5′- TCTGGCGAAGAA-CAATC -3′；β-actin特異性引物上游序列為:5′-CATCCTGCGTCTGGACCT-3′，下游:5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。提取胰腺組織中總RNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件(20 μl體系):SYBGreen mix 9 μl，cDNA(20 ng/μl)4 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，H2O 6 μl。擴(kuò)增條件:預(yù)熱50 ℃ 2 min，預(yù)變性95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán);以ΔCt值表示目的基因iNOS相對(duì)的表達(dá)量。

1.4.4胰腺組織中iNOS蛋白的表達(dá)變化采用SP法，石蠟切片脫蠟、水化；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2～3次各3 min；3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10 min；PBS緩沖液洗2～3次各5 min；抗原修復(fù)；PBS緩沖液洗2～3次各5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體；滴加Ⅰ抗50 μl，室溫靜置1 h或4℃過(guò)夜或37℃ 1 h。4 ℃過(guò)夜后需在37℃復(fù)溫45 min。PBS緩沖液洗3次各5 min；滴加Ⅱ抗40～50 μl，室溫靜置，或37 ℃ 1 h；Ⅱ抗中可加入0.05%的吐溫-20。PBS洗3次各5 min；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；自來(lái)水沖洗10 min；蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化；自來(lái)水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片;用Olympus BH-2顯微鏡觀察并攝片，采用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1胰島組織的病理學(xué)變化造模后7 w，對(duì)照組:外分泌腺與胰島間周界清楚，胰島形態(tài)完整規(guī)則，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)較多，排列緊密，分布均勻；模型組:外分泌腺與胰島間周界模糊，胰島形態(tài)極不規(guī)則。胰島細(xì)胞胞質(zhì)減少，胞核固縮深染，體積縮小。細(xì)胞排列紊亂；針刺、中藥兩組：均表現(xiàn)為外分泌腺與胰島邊界較模型組清晰，胰島形態(tài)不規(guī)則，胰島細(xì)胞排列緊密，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)均較多，分布較均勻；針刺+中藥組：胰島形態(tài)完整規(guī)則，胰島細(xì)胞體積較正常組增大，胰島細(xì)胞分布較模型組均勻。

2.2血糖水平變化與空白組比較，模型組血糖水平明顯升高(P=0.001 3)；與模型組相比，針灸+中藥組血糖的水平明顯降低(P=0.017)；針灸組或中藥組雖然血糖水平降低，但與模型組無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1，圖1。

2.3血清胰島素水平變化與空白組比較模型組血中胰島素水平明顯降低(P=0.003 6)，與模型組比較，針灸+中藥組血胰島素的水平明顯升高(P=0.005 7)；針灸組或中藥組雖然血胰島素水平升高，但與模型組無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.4胰腺組織NO含量變化與空白組比較模型組胰腺組織NO含量顯著增加(P=0.004 1)；與模型組比較針灸+中藥組胰腺組織NO含量顯著降低(P=0.033 6)；針灸組或中藥組雖然胰腺組織中NO含量降低，但與模型組無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.5胰腺組織iNOS蛋白及mRNA表達(dá)變化與空白組比較，模型組胰腺iNOS蛋白及mRNA表達(dá)均顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，針灸+中藥組胰腺iNOS蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)；針灸組或中藥組胰腺iNOS蛋白及mRNA的表達(dá)降低，但與模型組無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1，圖1。

圖1　各組胰腺組織iNOS的變化(×400)

組別血糖(nmol/L)胰島素(IU/ml)NO(U/L)iNOSmRNA空白組8.53±0.9880.64±19.880.072±0.0021.00±0.02模型組18.96±2.541)40.37±4.381)0.095±0.0131)4.37±0.051)中藥組8.56±1.4159.49±13.810.078±0.0113.68±0.03針刺組8.65±1.0665.77±8.120.080±0.0163.77±0.04針灸+中藥組8.34±0.862)78.15±9.292)0.066±0.0103)2.81±0.023)

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

3討論

腹腔內(nèi)注射STZ復(fù)制大鼠糖尿病，是研究糖尿病較為理想的動(dòng)物模型之一。本研究經(jīng)大鼠腹腔注射STZ(45 mg/kg，1次)，72 h后測(cè)定大鼠空腹血糖，其中80%以上血糖值≥11.1 mmol/L提示腹腔內(nèi)注射STZ，成功復(fù)制了大鼠糖尿病模型。盡管糖尿病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，國(guó)內(nèi)外研究一般認(rèn)為胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能受損是糖尿病兩個(gè)最重要的發(fā)病因素。就目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究來(lái)看，β細(xì)胞功能衰退在其發(fā)病中起了決定性的作用，胰島β細(xì)胞損傷是糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制〔9〕。近年來(lái)NO誘發(fā)胰島β細(xì)胞功能受損而致糖尿病這一機(jī)制越來(lái)越受到人們的關(guān)注。 NO是L-精氨酸經(jīng)iNOS催化生成的，其基因在生理情況下一般不表達(dá) ，而在一些誘導(dǎo)劑如免疫刺激因子的作用下可生成iNOS。iNOS一旦被誘生，可持續(xù)合成 NO，直至底物耗竭或細(xì)胞死亡〔10〕， iNOS是NO合成的關(guān)鍵因素。糖尿病NO過(guò)多〔11〕，高濃度NO是β細(xì)胞損傷的終末效應(yīng)因子，對(duì)胰島細(xì)胞造成損害， 導(dǎo)致凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可誘導(dǎo)(NF- κB)表達(dá)增多，經(jīng)一些細(xì)胞因子共同刺激后，激活 NF- κB轉(zhuǎn)錄因子使 iNOS表達(dá)增多，導(dǎo)致NO合成增加，使DNA受損引起細(xì)胞凋亡。iNOS抑制劑可減少NO的生成，減輕β細(xì)胞的凋亡〔12，13〕。本研究發(fā)現(xiàn)：針刺+中藥可以有效提高血中胰島素的水平，降低血糖及血中NO的水平，改善胰島的病理?yè)p傷。另外，研究還發(fā)現(xiàn)針刺+中藥可以從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平降低胰腺iNOS的表達(dá)，提示針刺聯(lián)合中藥能有效促進(jìn)胰島素分泌，發(fā)揮降血糖的功效，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)iNOS的表達(dá)從而降低血清中NO水平有關(guān)。

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〔2013-05-03修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)