2-丙基-4-戊烯酸血藥濃度與谷丙轉氨酶的關系

2-丙基-4-戊烯酸血藥濃度與谷丙轉氨酶的關系*

**通信作者 E-mail:xiejuan945@sohu.com

網絡出版時間：2015-09-11網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2250.012.html

吳斯1， 謝娟1**，李龍寬2

(1.貴州醫科大學附屬人民醫院， 貴州 貴陽550002； 2.貴州醫科大學第三附屬醫院， 貴州 都勻558000)

[摘要]目的： 研究癲癇兒童血液中丙戊酸毒性代謝產物2-丙基-4-戊烯酸(4-ene-VPA)血藥濃度與谷丙轉氨酶(ALT)的關系。方法： 選取96例癲癇兒童作為研究對象，采用反向高效液相色譜法(RP-HLPC)法測定患兒血漿中4-ene-VPA的血藥濃度，采用常規生化檢測法檢測患兒靜脈血中ALT的含量，并進行相關性分析。 結果： 0～≤2歲組癲癇患兒血漿中4-ene-VPA血藥濃度與ALT正相關(P=0.018，r=0.621)關系。結論： 對于0～≤2歲癲癇患兒，服用丙戊酸時應重點監測肝功能。

[關鍵詞]丙戊酸； 2-丙基-4-戊烯酸； 反向高效液相色譜法； 丙戊酸的代謝產物； 血藥濃度

[基金項目]*貴州省衛生廳基金(項目編號：gzwkj2010-1-003)

[中圖分類號]R917; R969.3

Correlation Analysis of Valproic Acid's Metabolites 2-propyl-

4-pentenoic in Plasma and Liver Function of Patients

WU Si1, XIE Juan2, LI Longkuan1

(1.People'sHospitalAffiliatedtoGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550002 ,Guizhou,China; 2.TheThirdAffiliated

HospitalofGuizhouMedicalUniversity,Duyun558000,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To explore the correlation between plasma concentration of sodium valproate's metabolites 2-propyl-4-pentenoic and ALT. Methods: A total of 96 cases of epileptic children patients who took sodium valproate medicine over 7 days and reached steady drug concentration in plasma were enrolled in this study. RP-HLPC was adopted to determine the blood concentration of 2-propyl-4-pentenoic. The ALT content in venous blood of patients was determined by conventional biochemical detection method. The correlation analysis between the blood concentration of 2-propyl-4-pentenoic and ALT content in venous blood was conducted by SPSS19.0. Results: The blood concentration of 2-propyl-4-pentenoic was positively correlated to ALT content in venous blood in 0～≤2 years old patients (P=0.018, r=0.621), but there was no significant correlation between the level of 4-ene-VPA and ALT in other age group. Conclusion： For 0～≤2 years old epileptic children patients who took sodium valproate, liver function should be monitored emphatically.

[Key words] valprioc acid; 2-propyl-4-pentenoic; reverse high-performance liquid chromatography; valproate's metabolites; plasma concentration

癲癇(epilepsy)是一種由多病因引起的慢性反復發作的神經系統疾病。據世界衛生組織(world heALTh organization，WHO)的報告癲癇的患病率在5.0‰～11.2‰，即大約全球有5 000萬的活動性癲癇患者；我國的癲癇患病率為7.2‰，目前大約有900萬的癲癇患者[1]。丙戊酸(valproic acid,VPA)是臨床廣泛使用的一線廣譜抗癲癇藥，是全面性發作及特發性全面性癲癇的首選藥，也可用于治療部分發作、繼發性全面發作及腦病性癲癇[2]。VPA臨床應用后，陸續有引起急性致死性肝壞死的報告。VPA誘發的肝衰竭多見于未成年或2歲以下的嬰幼兒[3]，目前認為VPA誘導的肝毒性與其自身代謝產物2-丙基-4-戊烯酸(2-propyl-4-pentenoic，4-ene-VPA)有關，被認為是引起其肝毒性的物質[4]。本實驗通過對4-ene-VPA濃度與未成年癲癇患者肝功能之間的關系進行研究，為臨床合理用藥提供理論基礎。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

4-ene-VPA標準品(純度98%，意大利Santa Cruz Biotechnology Inc),甲醇(色譜純,美國Mreda Technologyinc Inc)，乙腈(色譜純，天津市科密歐化工，批號2013111)，三乙胺(分析純，成都市科龍化工， 辛酸(分析純，生工生物)，對溴苯乙酰溴(純度98%，阿拉丁試劑公司)，水為超純水。

1.2儀器與色譜條件

Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，梅特勒-托利多AL204分析天平，超純水器 ，奧特賽恩AP-01P抽濾器， 江蘇康健XH-B旋渦混合器，上海理達PHS-3C pH計。色譜柱為ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(75∶25)，柱溫35 ℃，檢測波長為256 nm，流速1.0 mL/min,進樣量20 μL。

1.3研究對象

實驗方案經醫院倫理委員會討論并批準。本實驗共納入96例癲癇患者，其中男63例，女33例,平均(8.0±4.8)歲，平均體重(28.3±19.4)kg，平均身高(113±35.0)cm；單純服用VPA96例，合并服用吡拉西坦1例，合并服用卡馬西平1例，合并服用托比酯和拉莫三嗪1例，合并左乙拉西坦3例。將96例患者按照年齡分為5組，0～≤2歲組(n=14)、≥3～≤6歲組(n=30)、≥7～≤10歲組(n=22)、≥11～≤14歲(n=21)和≥15～≤17歲(n=9)。受試者納入標準包括：(1)根據2001年ILAE公布的癲癇發作分類及癲癇綜合癥分類標準確診，癲癇且服用丙戊酸鈉緩釋片(杭州賽諾菲制藥有限公司，規格500 mg/30片)或丙戊酸鈉口服液(杭州賽諾菲制藥有限公司，規格12 g∶300 mL)超過7 d以上，血藥濃度達到穩態；(2)年齡在18周歲以下，性別不限；(3)患者監護人知情同意。排除標準主要有:(1)未按醫囑服用藥物的患者；(2)患有消化系統疾病，如胃潰瘍、十二指腸潰瘍、完全或不完全腸梗阻；(3)入組前肝腎功能異常者。

1.4谷丙轉氨酸(ALT)檢測

ALT檢測采用生化常規檢測法。于患者次日服藥前抽取外周靜脈血置于抗凝管中，3 000 r/min離心5 min，取上層血漿置于EP管(1.5 mL)，-80 ℃冰箱保存，備用。

1.4.14-ene-VPA標準儲備液和標準血漿樣品精密稱取4-ene-VPA標準品4.00 mg于10 mL的容量瓶中，加入乙腈溶液并稀釋至刻度，即400 mg/L 4-ene-VPA儲備液，4 ℃保存。取儲備液分別配制10、20、40、80、160、200 mg/L 4 -ene-VPA標準溶液，4 ℃保存。取200 μL的血漿，加4-ene-VPA標準溶液20 μL，配制成濃度為1、2、4、8、16、20 mg/L 4-ene-VPA標準血漿樣品，4 ℃保存。

(1)為驗證本論文提出的SRBM算法預測評分的準確率，就硬聚類算法(K-means聚類算法)、隱語義模型(LFM)、自編碼器(autoencoder)、RBM以及SRBM算法在不同數據稀疏情況下準確率進行了分析比較。如圖8所示。

1.4.2內標精密稱取正辛酸4.00 mg于10 mL容量瓶中，加入乙腈溶液并稀釋至刻度，即得400 mg/L正辛酸儲備液，4 ℃保存。取儲備液配制4 mg/L內標液，4 ℃保存。

1.4.3衍生化試劑精密稱取對溴苯乙酰溴50.00 mg于5 mL容量瓶中，加入甲醇溶液并稀釋至刻度，即得10 g/L衍生化試劑，置4 ℃冰箱備用。

1.4.4血漿樣品的處理及衍生化精密吸取200 μL的血漿樣品置于1.5 mL Ep管中，加內標溶液20 μL，渦旋20 s,加2 mol/L硫酸100 μL，渦旋20 s；加1 mL乙酸乙酯進行萃取，渦旋1 min，靜置5 min，12 000 r/min離心10 min。吸取上清液置于1.5 mL Ep管中，加入30 μL三乙胺，20 μL對溴苯乙酰溴，渦旋20 s；70 ℃水浴30 min，氮氣揮干，殘渣用100 μL甲醇復溶，渦旋20 s，20 μL進樣。

1.5數據處理與分析

2結果

2.1方法學考察

4-ene-VPA和內標正辛酸與血漿中其他組份分離良好，保留時間分別為8.92 min和13.15 min。4-ene-VPA濃度在1～20 mg/L時呈良好線性關系y=0.268 0x+0.4119(r=0.992 8)，最低定量限為1 mg/L。在低、中、高質量濃度分別為0.061、0.004、0.016 mg/L下的回收率分別為114.5%，109.3%和97.1%。日間、日內RSD<15%(n=5)，符合生物樣品分析要求。

2.2不同年齡組4-ene-VPA血藥濃度與ALT的關系

表1　4-ene-VPA血藥濃度與

(1)P<0.05

注：A為0～≤2歲組患者4-ene-VPA血藥濃度的范圍，B為 ≥3～≤6歲歲組患者4-ene-VPA血藥濃度的圍，C為≥7～ ≤10歲4-ene-VPA組患者血藥濃度的范圍，D為≥11～ ≤14歲4-ene-VPA組患者血藥濃度的范圍，F為 ≥15～≤17歲歲組患者血藥濃度的范圍 圖1　各年齡組4-ene-VPA血藥濃度的范圍 Fig.1The blood concentration of 4-ene-VPA in different age groups

3討論

研究報道證實VPA所致肝臟病變均與其自身代謝致毒有關。約97%VPA通過由肝臟代謝。在肝臟內至少有3條途徑介導VPA的代謝，其中40%經線粒體ω-氧化途徑，30%～50%經由葡萄糖醛酸化途徑，10%～20%參與CYP450介導的β-氧化代謝，代謝途徑特征導致VPA的代謝產物多達50種[5-6]。4-ene-VPA是VPA經由CYP2C9、CYP2A6及CYP2B6代謝的產物，其中以CYP2C9、CYP2A6為主,。研究證實4-ene-VPA是致使VPA產生肝毒性的物質[7]。

4-ene-VPA在細胞內線粒體中在短/支鏈酰基-CoA脫氫酶(ACADSB)介導下生成4-ene-VPA-巰基輔酶A(4-ene-VPA-CoAthioester),再經β氧化生成(E)-2,4-diene VPA-巰基輔酶A[(E)-2,4-diene VPA-CoAthioester]過程中消耗了大量谷胱甘肽(CSP)，導致CSP局部耗竭[8-9]。由于線粒體是依靠GSH防止脂質過氧化反應，CSP的消耗造成了線粒體的功能障礙，導致肝細胞毒性。GSH是真核細胞中最豐富的巰基抗氧化劑，可與體內生成的氧化產物反應，從而減弱氧化應激；同時游離的輔酶A(CoA)在此過程中被惡意性消耗，造成CoA缺乏，使得內源性脂肪酸CoA依賴型氧化代謝反應受阻，能量生成障礙，最終導致細胞死亡。有研究指出4-ene-VPA濃度與VPA的濃度呈非線性關系[10]，因此有必要建立一種簡單快速的分析方法來對4-ene-VPA濃度進行分析。

本次研究發現0～≤2歲癲癇患兒的4-ene-VPA濃度與ALT(P=0.018，r=0.521)顯著相關，說明在特定范圍內C4-ene-VPA對患者肝功能是有指導意義的。ALT是臨床常用的檢測肝細胞損傷的指標，當肝細胞膜受損或細胞壞死時，ALT進入血清便增多，通過測定血清或血漿ALT的活性，即可反映肝細胞受損情況及損傷程度。因此可以得出2歲以下的兒童是VPA誘發的肝衰竭的危險人群。這與全美關于VPA致死性肝毒性病例資料調查回顧性得出的結論一致[11]，這可能是因為嬰幼兒時期代謝酶的種類及功能尚未發育完全。0～≤2歲的癲癇患兒作為肝損傷的高危人群，4-ene-VPA血藥濃度對其傷害程度較大，4-ene-VPA血藥濃度與ALT正相關的，所以對于2歲以下嬰幼兒，應重點關注肝功能的變化，及時調整給藥方案。

4參考文獻

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(2015-04-20收稿，2015-08-01修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華