重組槲寄生凝集素抗肝癌作用

重組槲寄生凝集素抗肝癌作用

楊學良任強王廣義1

(北華大學附屬醫院普外科，吉林吉林132011)

摘要〔〕目的探討重組槲寄生凝集素-Ⅰ(rVAA-Ⅰ)對體外培養的人肝癌細胞株SMMC-7721的抑制作用及相關機制。方法通過四氮唑比色法(MTT)、流式細胞術、透射電鏡及Caspase檢測rVAA-Ⅰ對SMMC-7721細胞增殖抑制效應，通過基因芯片分析找到差異基因。結果rVAA-Ⅰ誘導SMMC-7721細胞凋亡，在rVAA-Ⅰ濃度8 ng/ml時，有30%的細胞發生凋亡；在16 ng/ml時，細胞凋亡增加到44%；在32 ng/ml時，細胞凋亡達到51%。表明，rVAA-Ⅰ可以誘導SMMC7721細胞凋亡，并且具有劑量依賴性。在16 ng/ml時，隨著給藥時間的延長，對細胞抑制作用增強，48 h細胞的存活率最低，達30%，存在時間-效應關系，同時證實rVAA-Ⅰ誘導的細胞凋亡與Caspase有關。結論rVAA-Ⅰ具有直接抗SMMC-7721細胞作用,在腫瘤免疫學的基礎和臨床應用研究中具有前景。

關鍵詞〔〕SMMC-7721；重組槲寄生凝集素-Ⅰ；畢赤酵母

中圖分類號〔〕R57〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：任強(1960-)，男，主任醫師，主要從事消化道腫瘤研究。

1吉林大學第一醫院肝膽胰外科

第一作者：楊學良(1974-)，男，副主任醫師，博士，主要從事肝膽及胃腸道腫瘤研究。

槲寄生(Viscum album)是一類依賴落葉樹木生長的半寄生植物的總稱。早在1920年，奧地利學者就發現槲寄生的提取物是一種天然的抗癌藥物，近來的研究發現其中的植物凝集素(Agglutinin)在抗癌活性中發揮最為重要的作用〔1〕。從槲寄生提取物中可分離獲得種凝集素亞單位，均屬核糖體滅活蛋白家族，分別為槲寄生凝集素(VAA)-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ。而VAA-Ⅰ的生物活性最強〔2〕。本實驗擬證實rVAA-Ⅰ體外抗肝癌作用。

1材料與方法

1.1細胞株、主要試劑人肝癌細胞株SMMC7721購自吉林省腫瘤醫院。培養基：IMDM干粉(購于美國GIBCO公司)，溶解于800 ml蒸餾水中，加入100 μg/ml鏈霉素，100 IU/ml青霉素，NaHCO33.7 g， pH值調至7.2～7.4，過濾除菌，4℃保存。胎牛血清購于美國GIBCO公司，rVAA-Ⅰ為自制，流式細胞儀購于美國BD公司，細胞培養箱購于美國Forma Scientific 公司，凝膠分析系統購于瑞典Pharmacia公司。Human Genome Array、 SmartArray購于北京博奧生物。

1.2SMMC7721細胞的培養將SMMC7721細胞凍存管放入37℃的水浴鍋中溶解，復蘇的SMMC7721細胞加入含10%胎牛血清的培養液， 37℃培養，當細胞貼壁大于底的75%以上時進行細胞傳代，無菌凍存管中分裝，液氮中長期保存供使用〔3〕。

1.3MTT比色法測定rVAA-Ⅰ對SMMC7721細胞存活率的影響取對數生長期的SMMC7721細胞，胰酶消化成單細胞懸液， 37℃、5%CO2中培養。待細胞完全貼壁后換液，分別用終濃度為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0 ng/mL的rVAA-Ⅰ處理細胞，對照組加入等體積培養液，每組設4個平行孔，37℃、5%CO2中分別培養12、24、48 h。取出96孔板，每孔加入MTT溶液5 mg/ml 10 μl，37℃、5%CO2中繼續培養4 h，每孔加入DMSO 150 μl，于振蕩器上振搖，待藍紫色結晶物完全溶解后，在酶標儀上檢測A570處的吸光度值。分別計算不同濃度的rVAA-Ⅰ對SMMC7721細胞存活率的影響。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡采用FITC-AnnexinV/PI雙熒光標記，流式細胞術檢測細胞凋亡的變化情況。取對數生長期的SMMC7721細胞，用0.25%胰酶消化成單細胞懸液，計數調整細胞密度為1.5×105個/ml，每孔 3.0×105接種于6孔板中。培養至細胞完全貼壁后棄掉培養液，換成含不同濃度rVAA-Ⅰ的培養液，每個濃度4個平行樣。37℃、5%CO2培養箱內培養 24 h，收集細胞并用冷的PBS溶液沖洗兩次，調細胞濃度為1×105/ml。取1 ml，離心(1 000 r/min，5 min)棄上清，加入195 μl 結合緩沖液和5 μl FITC標記的AnnexinV抗體，常溫避光放置20 min。預冷的PBS洗2次，再加依次入190 μl 結合緩沖液和PI 10 μl，4℃、15 min避光保存。流式細胞儀收集1×104個細胞，用Cellquest軟件分析凋亡結果，以凋亡細胞的百分率表示。

1.5透射電鏡觀察細胞凋亡情況取對數生長期的SMMC7721細胞，培養至細胞完全貼壁后棄掉培養液，加入含終濃度為16 ng/ml的培養液進行干預，對照組加等體積的培養液。換成含不同濃度rVAA-Ⅰ(0.2、1.0、5.0 μg/ml)的培養液，每個濃度4個平行樣。培養 24 h后移入50 ml離心管中進行離心，棄去培養液固定2 h。按透射電鏡實驗要求制作樣品，經枸櫞酸鉛染色后在10 000倍視野下觀察細胞凋亡情況，隨機照相記錄觀察結果。

1.6Caspase抑制劑z-VAD-fmk對rVAA-Ⅰ抑制細胞增殖的影響處于對數生長期的SMMC7721細胞以1.5×105個/ml細胞密度接種于96孔板中，培養過夜；然后加入50 mmol/L的Caspase家族抑制劑z-VAD-fmk，繼續培養30 min；而后分別加入濃度為8、16、32 ng/ml rVAA-Ⅰ處理24 h后，MTT法計算抑制率〔4〕。

1.7芯片雜交采用22K Human Genome Array，共有21 522條Oligo DNA。Oligo庫用SmartArray點制在一張經過化學修飾、大小為7.5 cm×2.5 cm的載玻片上。取對數生長期的細胞，提取總RNA，探針標記、雜交、洗片，用LuxScan10KA雙通道激光掃描儀進行基因芯片掃描， LuxScan 3.0圖像分析軟件對芯片圖像進行分析。差異基因篩選，運用One timecourse分析方法，選擇FalseDiscovery Rate<0.1時差異顯著的基因，并對這些差異顯著基因的表達模式進行聚類分析。

1.8實時定量PCR根據芯片分析的結果，查找需要驗證的目的序列，設計引物，并交由北京英茂盛業公司合成，以反轉錄產物為模板，按照SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(QPK-201)說明書，加入各種反應物，常規反應條件，在美國Bio-Rad伯樂Chromo4多色實時PCR擴增儀上進行擴增反應。

1.9統計學方法采用SPSS12.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1rVAA-Ⅰ對SMMC7721細胞存活率的影響8 ng/ml的劑量下，可以顯示出對SMMC7721細胞的增殖具有較弱的抑制效果，當濃度增加到16 ng/ml時，抑制效果變得更為明顯。rVAA-Ⅰ可劑量依賴性地對SMMC7721細胞的增殖起到抑制作用，24 h的IC50為16 ng/ml。隨著給藥時間的延長，對細胞抑制作用增強，細胞的存活率明顯下降，存在時間-效應關系。見表1。

對照組VAA-Ⅰ濃度(ng/ml)124816326412812h100±1.4095.68±3.5692.34±5.5289.03±7.861)67.12±8.021)48.45±8.011)29.33±9.521)20.05±9.031)18.22±10.331)24h100±1.5090.12±6.8189.08±7.561)87.68±7.851)56.11±8.221)38.12±8.411)18.54±9.611)16.58±9.521)13.02±12.361)48h100±1.5089.12±7.911)88.68±7.911)85.65±7.961)54.68±8.351)30.78±8.561)19.25±9.881)14.37±9.931)11.38±12.931)

與對照組比較:1)P<0.05

2.2rVAA-Ⅰ可以誘導SMMC7721細胞凋亡不同濃度的rVAA-Ⅰ處理SMMC7721細胞24 h，分別用Annexin V-FITC與PI分別檢測細胞早期凋亡與末期細胞凋亡情況，在各個劑量組中凋亡細胞的數量同對照組相比均有所增加。結果表明，rVAA-I可以誘導SMMC7721細胞凋亡，并且具有劑量依賴性。

2.3rVAA-Ⅰ誘導的細胞凋亡與Caspase有關50 mmol/L的Caspase抑制劑z-VAD-fmk可以顯著抑制rVAA-Ⅰ誘導的SMMC7721細胞凋亡。8、16、32 ng/ml VAA-Ⅰ時caspase水平分別為(54.68±8.35)%、(30.78±8.56)%、(19.25±9.88)%，與對照組差異顯著(P<0.05)。

2.4透射電鏡觀察rVAA-Ⅰ對肝癌細胞的影響透射電鏡下可見經rVAA-Ⅰ(16 ng/ml)處理的SMMC7721細胞出現核固縮、核膜破裂、消失，染色質凝集、細胞質中空泡增多，核間隙明顯變寬、核膜消失，細胞器結構不清，核斷裂等現象(白色箭頭)。而對照組細胞體積較大，核質比例較高，常染色質豐富，異染色質較少，沿細胞核膜分布，核仁居中或邊移，細胞質內線粒體豐富。見圖1。

圖1　透射電鏡觀測rVAA-Ⅰ(16 ng/ml) 處理的SMMC7721細胞的形態學改變(×8 000)

2.5基因芯片分析結果對照組和給藥組之間的差異基因使用了Limma算法進行顯著性水平的計算，篩選標準為：LogFC>1或者LogFC<-1，錯誤發現率(FDR)<0.01,B值>1.5的基因為差異基因，整體芯片找到3 200個差異基因用于后續實驗分析，綠色為下調基因，紅色為上調基因，見圖2。

圖2　差異基因分析結果

2.6定量RT-PCR結果MAPK信號通路中的3個差異表達基因MAPK14，IMPA1和SMNDC1與基因芯片的分析結果完全一致，證實基因芯片的分析結果是可信的。

3討論

手術切除為肝癌獲得根治的最佳手段，但肝癌發現多屬于晚期，手術難以切除，且術后容易復發〔5〕。研究報道，根治性手術切除后，仍有60%～70%的患者在5年內出現轉移和復發。而目前市場上的化療藥物也不盡如人意，存在著骨髓抑制、消化道反應、嘔吐等嚴重的毒副作用。

槲寄生在歐美被稱為“生命中的金枝”〔2〕。專家預測槲寄生有望成為繼紫杉醇之后又一種天然抗癌藥物〔2,6〕。VAA-Ⅰ的獲得主要是采用傳統的分離、提取方法從槲寄生中獲得，由于其含量低，提取分離方法復雜，限制了其應用〔7〕。畢赤酵母是低等真核生物，于20世紀80年代初開發獲得，非常有利于真核基因的表達，具有對外源表達蛋白進行正確加工，修飾及合理的空間折疊等功能，能有效克服大腸桿菌等原核表達系統缺乏蛋白翻譯后加工、修飾的不足；同時，酵母細胞具有生長快，操作簡單，易于培養等原核生物的優點。因此，畢赤酵母表達系統受到越來越多的重視，已廣泛用于重組蛋白質的生產，被美國食品和藥品管理局(FDA)證實為是安全、可靠的，其表達的藥用蛋白不需進行大量的宿主安全性實驗。

SMMC7721細胞的全基因組轉錄譜表明，大量的基因表達發生在rVAA-Ⅰ殺傷細胞的過程中。一些與核相關的GO分類，包括MAPK信號通路(RAP1B，MAPK14，FLNA)的細胞凋亡(SMNDC1)，蛋白酶(PSMA2，PSMA4)，核黃素代謝(RFK，MTMR6)，色氨酸代謝( FANCL，BRAP)，TGF-β的信號通路(AMH)，磷脂酰肌醇信號的系統(IMPA1)和氧化磷酸化(PPA2)〔8〕。本研究中，當細胞暴露于rVAA-Ⅰ FLNA，MAPK14，RAP1B的基因表達改變。FLNA已經牽連的各種胞外刺激誘導的MAPK信號，并且它可以與MAPK激酶MEK1和MKK4〔9〕進行交互。它也可以是核糖體蛋白S6激酶ERK的目標〔4〕。此外，還涉及了幾個基本的細胞功能，如黏附，遷移，極性，分化和增長。綜上，體外證實了VAA-Ⅰ抗肝癌作用，為體內研究奠定了基礎。

4參考文獻

1龔祝南. 槲寄生類植物抗腫瘤活性蛋白成分的結構、功能及其作用機制的研究進展 〔J〕. 中國生化藥物雜志,2001;22(5):259-62.

2Bussing A,Suzart K,Bergmann J,etal. Induction of apoptosis in human lymphocytes treated with Viscum album L. is mediated by themistletoe lectins〔J〕. Cancer Lett,1996;99(1):59-72.

3徒震強,吳軍正. 細胞培養 〔M〕. 北京：世界圖書出版公司,2004：138.

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7周彬,楊文革,繆建,等. 槲寄生凝集素粗品提取工藝研究 〔J〕. 中成藥,2007;29(5):162-4.

8Scott MG,Storez H. Cooperative regulation of extracellular signal-regulated kinase activation and cell shape change by filamin A and β-arrestins 〔J〕. Mol Cell Biol,2006;26:3432-45.

9Momoi T. Caspases involved in ER stress-mediated cell death 〔J〕. J Chem Neuroanat,2004;28:101-5.

〔2013-11-25修回〕

(編輯苑云杰)