香煙提取物對大鼠血管內皮細胞的損害

香煙提取物對大鼠血管內皮細胞的損害

朱濤李鋒1嚴飛劉正霍強

(新疆醫科大學第一附屬醫院心臟外一科，新疆烏魯木齊830011)

摘要〔〕目的探究香煙提取物(CSE)對大鼠血管內皮細胞(VEC)的影響。方法利用原代培養的方法獲得大鼠主動脈VEC(RVEC)，采用不同濃度的CSE處理RVEC，分別用MTT和流式細胞儀來檢測三組細胞的增殖和凋亡情況，并檢測細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放情況。同時，采用雙抗體夾心ELISA法檢測細胞分泌的腫瘤壞死因子(TNF)-α、基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10的情況。結果MTT實驗中，與0.05%組相比，0.5%濃度組的細胞生長顯著變慢(P<0.05)，且這種抑制作用呈現劑量依賴性。LDH釋放結果顯示，與0.05%組相比，20%濃度的CSE處理可導致細胞LDH釋放顯著升高(P<0.01)，且隨著CSE濃度的進一步升高，LDH釋放逐漸增多。經過24 h后，CSE處理后的細胞凋亡逐漸增多，差異明顯(P<0.01)。而對于細胞分泌的TNF-α、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10含量，CSE干預組均比對照組明顯增加(P<0.01)。結論CSE可以明顯抑制RVEC的生長，加劇其凋亡，并促進細胞分泌TNF-α、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10的能力。

關鍵詞〔〕香煙提取物；血管內皮細胞；細胞增殖；細胞凋亡；腫瘤壞死因子α

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：霍強(1967-)，男，碩士生導師，副教授，主任醫師，主要從事心胸外科學研究。

1伊犁州友誼醫院心血管介入科

第一作者：朱濤(1979-)，男，碩士，主治醫師，主要從事心胸外科學研究。

血管壁異常主要指血管內皮細胞(VEC)損傷，是造成急性冠脈事件的重要原因，也是糖尿病腎病等疾病發生的共同病理環節。香煙及其煙霧中含有上千種化合物和有毒物質，都具有刺激性和潛在致癌性。吸煙是諸多血管缺血性疾病如動脈硬化閉塞、血栓閉塞性脈管炎等疾病的重要危險因素〔1～6〕，本研究通過檢測香煙提取物(CSE)對原代培養的大鼠主動脈VEC(RVEC)內皮細胞的損傷，探討此類疾病的發生機制。

1材料與方法

1.1材料DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青、鏈霉素和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自HyClone公司；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、溴化丙啶(PI)購于Sigma公司；Rnase購于上海生工； ELISA試劑盒購自上海恒遠生物技術發展有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠RVEC懸液的制備無菌操作取出大鼠主動脈，立即在無菌D-Hank液洗凈血管外壁血液及分離脂肪組織等，并用注射器將血管內血液沖洗干凈，剪成大約2 mm×2 mm的動脈片，然后貼入滅菌25 mm培養瓶中，置于37℃,5% CO2培養箱內進行原代培養。

1.2.2CSE的制備使用國產某品牌香煙，參照Nakamura等〔7〕：將煙嘴與泵相連，通過泵的抽氣作用，使去掉過濾嘴的香煙燃燒，按每包煙通入1 000 ml Hank液制成懸液。懸液調至pH 7.4，經孔徑0.2 μm微孔濾膜過濾除去細菌和大顆粒備用。

1.2.3MTT檢測將制備的大鼠RVEC以每孔5 000個細胞接種于96孔培養板培養,將培養板移入CO2孵箱中,在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下常規培養。細胞貼壁后通過換液分成對照組和不同濃度的CSE干預組，將各組細胞培養3 d后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl,繼續培養4 h,終止培養,小心吸棄孔內培養上清液,每孔加入DMSO 150 μl,輕輕振蕩10 min,使結晶充分溶解,用酶聯免疫標記分析儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度A值(A 490)。細胞增殖抑制率(%)=(對照孔OD值-試驗孔OD 值/對照孔OD值)×100%

1.2.4細胞凋亡檢測將大鼠RVEC分為對照組，5%、10%和15%CSE干預組，繼續培養24 h后，倒去培養基，胰酶消化細胞，離心去上清，PBS洗滌2次。加0.3 ml PBS重懸細胞，加入4 ml 70%乙醇(預冷)，4℃過夜固定，離心收集細胞，PBS洗滌2次，0.5 ml PBS重懸細胞，加入50 μg/ml RNase，37℃消化30 min，再加入50 μg/ml的PI，37℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5細胞中細胞因子含量的檢測將大鼠RVEC分為對照組，5%、10%和15%CSE干預組，培養至單層貼壁融合后，將培養基更換為無血清培養基，37℃、5% CO2孵箱中過夜培養，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書進行實驗，每組設3個復孔，用酶標儀在450 nm處讀取OD值。

1.3統計學方法應用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1CSE對RVEC細胞增殖的影響MTT結果顯示，當RVEC經過不同濃度CSE處理后，與0.05%組相比，0.5%濃度組的細胞生長顯著變慢(P<0.05)，說明CSE可以抑制大鼠RVEC的增殖，并且這種抑制作用呈現劑量依賴性。乳酸脫氫酸(LDH)釋放結果顯示，與0.05%組相比，20%濃度的CSE處理可導致細胞LDH釋放顯著升高，且隨著CSE濃度的進一步升高，LDH釋放逐漸增多，提示20%或更高濃度的CSE破壞RVEC細胞膜的通透性。綜合上述結果，后續實驗選擇既有很好抑制效果，又不會破壞RVEC細胞膜通透性的5%、10%和15%濃度的CSE處理細胞。見表1。

2.2CSE對大鼠RVEC凋亡的影響流式細胞儀分析顯示，CSE作用大鼠RVEC 24 h后，與對照組相比，凋亡率顯著增加，并且隨著CSE作用濃度增加，凋亡率也隨之增加(P<0.05)，并且，早期凋亡和晚期凋亡與總體凋亡的趨勢相同。見表2。

CSE濃度早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率對照組5%10%15%P值7.237±2.14212.054±1.36319.872±2.38525.165±4.16<0.053.444±1.09714.656±2.08522.734±2.03531.325±4.525<0.0510.731±0.44226.750±0.74542.566±0.30656.335±0.713<0.05

2.3CSE對細胞中腫瘤壞死因子(TNF-α)含量的影響ELISA結果顯示，與對照組〔(10.227±1.903)pg/ml〕相比，CSE過夜處理細胞后，大鼠RVEC中的TNF-α含量明顯增加5%、10%、15%，CSE組TNF-α含量分別為(16.743±2.835)、(24.663±2.382)、(38.435±3.935)pg/ml，說明CSE可以促進大鼠RVEC分泌TNF-α，并且這種促進作用具有劑量依賴性(P<0.05)。

2.4CSE對細胞中基質金屬蛋白酶(MMP)含量的影響 ELISA結果顯示，與對照組相比，CSE過夜處理細胞后，大鼠RVEC中的MMP含量明顯增加，說明CSE可以促進大鼠VEC分泌MMP，并且這種促進作用具有劑量依賴性(P<0.05)。見表3。

CSE濃度MMP-1MMP-2MMP-3MMP-10對照組87.832±7.392203.483±30.49112.934±1.38411.956±2.0455%146.342±14.825312.495±57.90217.493±2.95715.923±3.02310%201.492±22.935429.495±73.45228.394±3.20126.934±2.94815%291.934±45.924502.935±88.94240.394±3.94237.024±3.814P值<0.05<0.05<0.05<0.05

3討論

香煙及其煙霧中含有的有毒物質對生物大分子如核酸、脂類和蛋白質的損傷都很嚴重。RVEC在維持血管功能方面發揮著重要作用，許多心腦血管常見疾病的發生，本質上都是血管內皮受損所致的內皮功能異常。其中，吸煙是重要的損傷因素之一。然而，對于吸煙造成血管內皮損傷的機制卻并不清楚。有研究〔8〕表明，吸煙介導的過度氧化應激可能是重要誘因。煙霧中的氧自由基和其他氧化劑的濃度較高，直接滅活內皮源一氧化氮或者與一氧化氮結合形成具有強烈細胞毒性的過氧化氮，導致內皮細胞一氧化氮活性降低；引起脂蛋白氧化，氧化型低密度脂蛋白逐漸聚集，從而啟動動脈粥樣硬化；增加血管緊張素轉換酶的活性，進一步增加炎癥細胞因子的表達、黏附和活化，對血管內皮造成損害〔9〕。

本研究結果發現CSE可以抑制大鼠RVEC增殖，同時促進其凋亡。在細胞受到損害的過程中，TNF-α、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-10分泌增多，這些細胞因子分泌增多反過來又會進一步損傷RVEC，形成惡性循環，這些現象可能就是香煙煙霧中的氧自由基導致的一系列后果。本研究為保護內皮細胞的臨床治療和藥物篩選提供了一定的理論依據。

4參考文獻

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〔2014-05-20修回〕

(編輯袁左鳴)