閬中市副豬嗜血桿菌病的分子流行病學調查及主要血清型確定

李建華，沈峻宇 ，楊 嵩，陳定超

（1.四川省閬中市畜牧局，四川 閬中 637400；2.四川省南充市順慶區畜牧局，四川 南充 637000；3.四川省畜牧總站，四川 成都 610041）

副豬嗜血桿菌（HPS）起初被稱為豬嗜血桿菌或豬流感嗜血桿菌，是豬上呼吸道的一種常在菌[1]。該菌常與其他呼吸道病原混合或繼發感染[2-4]，主要的攻擊對象是仔豬和青年豬。本試驗對閬中市16個規模化豬場進行了HPS流行病學調查，為當地有效防控該病提供依據。

1 試驗材料

1.1 病料來源及實驗動物 病料來源于閬中市的16個規模化養豬場，采集自疑似患副豬嗜血桿菌病的豬的肺臟、鼻拭子、氣管黏液、淋巴結、腎臟、脾臟、關節液和心包滲出液等。

副豬嗜血桿菌的陽性病料由四川農業大學動物醫學院動物檢疫實驗室保存并提供。試驗中用于制備各個分型血清的健康家兔（體重3～4kg/只），購自四川農業大學農場。

1.2 所需分子生物學試劑 蛋白酶K、SDS、Ttis飽和酚，2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker DL2000、pMD19-T Vector，瓊脂糖，NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），Column DNABACK柱式DNABACK，細菌基因組DNA提取試劑盒，其他試劑如無水乙醇、氯仿等均為國產分析純。

1.3 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50FB，電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9146A，高速冷凍離心機Sigma 3-18K，恒溫水浴鍋，微量加樣器，PCR儀Mycycler，核酸電泳系統DYY-2C，穩壓穩流型電泳儀DYY-III-8B，全自動凝膠成像分析系統，渦旋混合振蕩器，水浴鍋。

1.4 培養基 LB培養液、LA培養基、TSA培養基、TSB培養液和氨芐平板，其制備均按照說明書進行。

1.5 引物的設計與合成 從Genbank上下載已經公布的HPS 16S rRNA核苷酸序列，根據HPS 16S rRNA序列設計引物，引物由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

表1 HPS引物設計

按使用說明將引物稀釋為10pmol/μL，放-20℃冰箱中備用。

2 方法

2.1 細菌分離培養 用無菌接種環蘸取肺臟組織、氣管黏液、心包滲出液和關節液接種在含0.05%NAD的TSA 培養基上，置37℃溫箱中培養24～48h，觀察細菌菌落，再進行細菌純培養。

2.2 HPS的PCR鑒定 PCR鑒定按Oliveira等建立的HPS PCR鑒定方法進行HPS 16S rRNA基因的PCR擴增，擴增片段大小為821 bp。細菌基因組DNA的抽提按細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進行。采用PCR技術對提取的DNA進行擴增，同時做陰性對照和陽性對照。反應體系（20μL）為：2×Taq PCR MasterMix 10μL，雙蒸水 5μL，上游引物和下游引物各1μL，DNA模板3μL。

取8μL PCR產物加入1%瓊脂糖凝膠板加樣孔中，同時取8μL DNA Marker DL2000作為參照物，在120V電壓下電泳20min，結束后將1%瓊脂糖凝膠放于紫外凝膠成像儀中觀察并保存圖像。

2.3 HPS 16S rRNA克隆與序列分析 若2.3中出現正確的目的條帶（821bp），則進行基因克隆與序列分析。

2.3.1 凝膠塊中DNA的膠回收、純化 膠回收按照下列步驟進行：在膠回收離心管中按重量比1∶3～1∶5加入通用溶膠液（即：100mg的瓊脂糖凝膠需要加入300～500μL通用溶膠液），放50℃水浴鍋中使膠完全溶化；將離心管中的溶液轉到離心吸附柱中，套上收集管，靜置3min，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的液體，加入0.7～0.8mL的通用洗柱液，室溫靜置2min，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的液體，再以12000r/min離心30s，以除去離心柱中的殘留液體；將離心柱放于一支新的干凈的離心管中，加入30～100 μL 50～65℃的 DNA 洗脫液，靜置 3 min，12 000r/min離心1min，離心管里所得的溶液即為膠回收產物。放于-20℃冰箱中備用。

2.3.2 感受態細胞的制備 將大腸桿菌DH5α貯存液在無菌LA平板上劃線，37℃培養箱培養過夜，挑取單個菌落接種到一只裝有5mL LB培養液的滅菌試管中，37℃ 200r/min振蕩培養過夜，按照1%（V/V）比例接入新鮮LB培養液，取2mL接種于100mL LB培養液中，37℃ 200r/min振蕩培養2～2.5h，測得OD值為0.5左右（此時細菌處于對數生長期）。將菌液加入到無菌EP管中，冰上放置10min后，4℃ 5000r/min離心10min，棄上清，將菌體懸浮于10mL的無菌、預冷的0.1mol/L的CaCl2溶液中，4℃ 3000r/min離心10min，棄上清，再將菌體懸浮于2mL的無菌、預冷的已經加入甘油的0.1mol/L CaCl2溶液中（甘油按照15%比例加入），分裝到無菌1.5mL EP管中，放4℃冰箱過夜后，置于-70℃冰箱中保存備用。

2.3.3 連接 將膠回收產物與pMD19-T載體連接，反應體系（10μL）為：Solution I 5μL，pMD19-T 1μL，膠回收產物4μL。16℃連接過夜。

2.3.4 轉化 在無菌條件下，將新鮮制備或者在-70℃保存備用的DH5α感受態細胞在冰上溶解后輕輕混勻。取10μL連接產物，無菌加入已經均勻懸浮的100μL DH5α感受態細胞中，溫和搖勻，冰浴30min，42℃水浴，熱激90s。冰浴3～5min（使感受態細胞的細胞膜通透性增加，讓質粒充分進入細菌內），加入37℃的900μL LB培養液（無Amp），在37℃水浴鍋內250r/min溫和振蕩1h，使細菌恢復耐藥性。室溫下，3000r/min離心5min，棄去700μL上清液，用剩余的培養液將細菌沉淀懸浮，均勻涂布于氨芐平板上，在37℃培養箱中正向放置30min吸取掉多余液體后，倒置，培養10～16h。無菌挑取單個菌落接種于3～4mL含Amp溶液的LB培養液中，37℃ 250r/min振蕩培養 6～8h。然后按 7∶3（菌液∶甘油）分裝至無菌EP管中，其中一管用于測序，其余放-70℃冰箱內保存。

2.3.5 序列比較 從NCBI上下載已經公布的HPS 16S rRNA 序列（登錄號：AB004039.1、AB004037.1、AB004036.1、AB004035.1、AB004034.1），將這些基因的相應區域與測序結果用DNAMAN軟件進行比對，查看其同源性。

2.4 血清型的確定 本試驗用蘭州獸醫研究所饋贈的血清型1～15標準株來制備副豬嗜血桿菌分型血清，并根據玻板凝集試驗[5]確定HPS的血清型。

2.4.1 分型血清的制備 分別用血清型1～15標準株劃線接種于TSA平板上，37℃培養24～48h，挑取單個菌落，接種于含4～5mL TSB培養液的試管中，37℃ 250r/min振蕩培養6～8h后涂布于TSA平板，放37℃培養箱中培養24～48h，然后用含0.2%福爾馬林的PBS（pH=7.2）沖洗下來，37℃過夜滅活，4℃4000r/min離心10 min，洗滌兩次，調整菌液濃度，使得OD600約等于1。然后均分成兩份，其中一份與等量的弗氏完全佐劑制成弗氏完全佐劑疫苗，另一份與等量弗式不完全佐劑制成弗式不完全佐劑疫苗。

每株標準株都按以下程序免疫健康家兔2只：用1.5mL弗氏完全佐劑疫苗于背部多點注射（第一次免疫），14d后再用1.5mL弗氏完全佐劑疫苗于背部多點注射（第二次免疫），11d后用3mL弗式不完全佐劑疫苗于背部多點注射（第三次免疫）；11d后用0.5mL病菌新鮮培養物（OD600值≈1）對每只家兔進行耳靜脈注射攻毒，7～14d后采血，無菌分離血清，做玻板凝集試驗測血清抗體，若出現明顯肉眼可見的凝集物就放血收集血清，若沒有凝集物出現，就繼續用0.5mL病菌新鮮培養物攻毒，7～14 d后再采血檢測，仍然不合格就重新免疫。以健康家兔的血清作陰性對照。所有血清于-20℃保存備用。

2.4.2 血清學分型 用PBS沖洗下TSA平板上生長的各分離株菌苔作為待檢菌液，將0.3mL待檢菌液與0.3mL分型血清混勻，同時用健康家兔血清作陰性對照。數分鐘后，若混合液仍均一渾濁，則為陰性反應；若出現肉眼可見的凝集物，則為陽性反應，表示分離株與產生凝集物的標準株的血清型相同。

3 結果

3.1 流行病學調查結果 196份疑似HPS病料主要采集自21～60日齡的斷奶仔豬和保育豬，疑似病例全年都有發生，但在4～9月份相對集中。在所調查的196份病料中，共分離出了11株HPS，分離率只有5.61%，其中有9株是4～9月采集病料時分離出的，表明該病在4～9月發生明顯；分離出的HPS病料主要來自斷奶仔豬和保育豬，分離部位主要在肺臟和支氣管，肺臟、支氣管和關節液的分離率分別為54.5%（6/11）、36.4%（4/11）和 9.1%（1/11），說明肺臟和氣管是HPS存在的主要器官。

3.2 細菌分離培養結果 培養基上的細菌菌落光滑濕潤，呈針尖大小、無色透明的露珠狀，約0.5 mm左右。取純培養36h的菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢，結果為革蘭氏陰性細小桿菌。

3.3 HPS的PCR鑒定 使用HPS 16S rRNA基因擴增引物對分離的細菌進行16S rRNA基因擴增，結果從分離的細菌基因組DNA中均擴增出821 bp的目的片段。

3.4 HPS 16S rRNA序列分析 結果見表2。根據HPS 16S rRNA序列設計引物，經PCR技術擴增后，電泳發現產物條帶大小為821bp，與預期相符。將分離到的11株HPS的PCR產物送到華大基因公司測序，將測序結果與標準株進行比對，結果發現其同源性為96.2%～99.76%，說明檢測出的確實是副豬嗜血桿菌陽性病料，而且HPS 16S rRNA序列保守性較高，不會因為地域不同發生很大的變異。

表2 同源性比對結果

3.5 HPS分離株的血清型鑒定結果 將分離到的11株HPS的菌液0.3mL與各分型血清0.3mL混合均勻，通過玻板凝集試驗進行血清型分型，同時用健康家兔血清作陰性對照，結果顯示有8株能夠準確分型，有2株出現交叉反應，難以判斷，有1株不能與這15種分型血清發生陽性反應，不能分型。在能分型的菌株當中，血清型依次是5型4株、4型3株、12型1株。各分離株的血清型及其分布地區見表3。

表3 各分離株的血清型及其分布地區

4 討論與小結

本試驗從196份疑似病料中檢出了11份陽性病料，陽性檢出率較低（為5.61%），可能是臨診時把副豬嗜血桿菌病與支原體肺炎、傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病等病混淆，致使所采集的病料不完全是副豬嗜血桿菌病陽性病料。從采集時間推斷該病在春、冬季的發病率低于夏、秋季。該試驗還成功地克隆了這11株HPS的16S rRNA，將這些序列與NCBI上已公布的HPS序列進行同源性分析，發現其同源性在96.2%～99.76%之間，具有較高的保守性。

目前副豬嗜血桿菌的分型方法主要有血清學分型、基因分型、多態性圖譜分型。副豬嗜血桿菌血清型眾多，制備血清型1～15的各個分型血清是一件很困難且耗時耗力的工作。本試驗發現，不同血清型的菌株刺激動物機體產生抗體的水平有很大差異，其中血清型 15、14、13、12、11、9、6、5、3 的菌株在第一次攻毒后就可與相應的熱穩定性抗原發生明顯的陽性反應，而血清型10、8的菌株需要連續攻毒3次才能獲得比較滿意的結果。

有研究報道，采用瓊脂擴散方法對HPS進行血清型分型時，抗原制備的方法對HPS血清學分型的效果有較大影響[6-7]。本試驗用玻板凝集試驗對分離株進行血清分型，避免了瓊脂擴散方法中抗原制備不當而對試驗結果造成影響。

近年來，副豬嗜血桿菌的耐藥性越來越明顯，國家對抗生素在動物飼料中的應用限制得比較嚴格，所以疫苗會逐步取代抗生素，成為預防、控制本病的主要措施[8]。但在實際生產中，有的疫苗免疫效果并不明顯，這可能與血清型有關；也可能是因為臨床上用的大都是滅活苗，而滅活苗的交叉保護性低、免疫原性差，不能刺激機體產生免疫應答反應；還有可能與豬群的健康狀況有關。

不同血清型的副豬嗜血桿菌的毒力和致病力存在差異，毒力和免疫保護作用呈正相關。母安雄等[9]研究報道：血清型 5、1、10、13、12、14 為高毒力菌株，血清型 4、2、15 為中等毒力菌株，血清型 6、3、7、8、11為無毒力菌株。本次在閬中市分離出的HPS的血清型主要是5型、4型和12型，這些血清型的菌株基本上都是高毒力菌株。在制備針對閬中市HPS的有效疫苗時，可以將高毒力的血清型5、4、12菌株通過誘導發生突變，再選出毒力減弱的菌株制備成弱毒疫苗，這樣應該有明顯的免疫效果且對仔豬的安全性較高。

[1]賀英，趙萍，儲岳峰，等.福建省部分地區副豬嗜血桿菌病的流行病學調查[J].貴州農業科學，2010，38（2）:130-131.

[2]Oliveira S，Pijoan C.Computer-based analysis of Haemophilus parasuis protein fingerprints[J].Canadian Journal of Veterinary Research，2004，68（1）:71.

[3]Biberstein E L，White D C.A proposal for the establishmentoftwo new Haemophilusspecies[J].Journal of Medical Microbiology，1969，2（1）:75-78.

[4]王祝榮，盧寄軍，張進.副豬嗜血桿菌16S rRNA基因的克隆及序列分析[J].中國畜牧獸醫，2012，39（3）:92-94.

[5]趙冉，陳瓊，蔡振鴻.副豬嗜血桿菌病的研究進展[J].福建畜牧獸醫，2008，30（3）:20-23.

[6]陸國林，何海健.副豬嗜血桿菌病的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2009（12）:162-165.

[7]涂玉蓉，李美娣，卓曲，等.副豬嗜血桿菌分型方法的研究進展[J].福建畜牧獸醫，2012，34（5）:44-46.

[8]蘇丹萍，王文豪，章勝，等.副豬嗜血桿菌弱毒疫苗的研制[J].中國畜牧獸醫，2012，39（11）:169-173.

[9]母安雄，應小飛，陶益，等.副豬嗜血桿菌的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2006，32（11）:48-50.