鞘內注射KG—501對神經病理性疼痛大鼠疼痛的影響

摘要：目的 觀察鞘內注射KG-501對腰段背根神經節慢性壓迫模型（CCD）大鼠神經病理性痛的影響。方法 SD雄性大鼠30只按隨機數字表法分為三組：假手術組（S組，n=10）、CCD+DMSO模型組（T0組，n=10）、KG-501組（T1組，n=10）。T0、T1組制備CCD模型，S組僅暴露L4-5椎間隙。術后14dT0組鞘內注射30μL10%溶媒二甲基亞砜（DMSO），T1組鞘內注射溶于10%DMSO的KG-501 25μmol/30μL。各組在造模前1d，造模后第4d、7d、10d、14d（t1-t5）均檢測熱縮足反射潛伏期（PWTL）和機械性縮足反射閾值（PWMT）。T0、T1組給藥后2h、4h、10h、12h、24h（t6-t10）時進行上述行為學檢測。結果 與S組比較，T0、T1組在t2-t10時PWTL縮短，PWMT降低（P<0.05）；與T0組比較，T1組在給藥后t7-t9時PWTL（12.9±1.0VS16.8±2.0、13.1±1.3VS20.6±2.1、12.4±1.3VS15.8±1.6）（s）延長，PWMT（9.2±1.7VS12.5±1.2、9.1±1.7VS16.7±3.7、9.2±1.8VS12.7±1.8）（g）升高（P<0.05）。結論 鞘內注射KG-501可有效緩解神經病理性痛大鼠的疼痛反應。

關鍵詞：KG-501；CCD模型；CREB；神經病理性疼痛；大鼠

神經病理性疼痛被認為是由外周或中樞感受系統的病變或者受疾病影響而產生的慢性疼痛[1]。坐骨神經痛作為臨床常見的一種慢性神經病理性疼痛，帶來了重要的醫學和社會經濟問題[2]。數以千例的病例研究表明，硬膜外注射皮質類固醇可以有效地治療神經病理性疼痛[3]。雖然多數患者經保守治療好轉，但仍有約10～15%的患者需要外科手術治療[4]。因此探討研究治療神經病理性疼痛的藥物至今仍然有意義。Xiaoping Gu[5]等人建立的大鼠CCD模型比較理想地模擬了坐骨神經痛的病理特征及臨床癥狀，是目前研究神經病理性疼痛的較好模型。

Marie K.等人表明，在脊髓激活cAMP途徑使環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）磷酸化并且產生機械痛覺過敏[6]。Xue-song Song[7]及薄靳華[12]等人的研究表明，CCI模型的大鼠磷酸化CREB水平均顯著上升，細胞外調節蛋白激酶（ERK）激活的途徑部分參與到CCI大鼠的神經病理性疼痛形成，ERK的磷酸化可能是通過CREB依賴的基因表達完成的。本實驗擬通過對大鼠進行鞘內注射CREB與其結合蛋白（CBP）結合抑制劑KG-501[8]，來觀察CCD大鼠痛覺過敏的行為學影響。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實驗動物與飼養 SPF級健康雄性SD大鼠200～220g（南京市鼓樓醫院實驗動物中心提供），自由飲水和攝食，光照周期12h，光照時間8：00～20：00，室溫24～25℃。行為學測試前適應環境1w。實驗動物的使用嚴格遵守南京大學動物保護和使用規定。

1.1.2儀器與試劑 PLANTAR TEST（UGO BASILE Model 37370，意大利），DYNAMIC PLANTAR AESTHESIOMETER（UGO BASILE Model 37450，意大利）；KG-501（美國Sigma-Aldrich公司）；SURGIFLO？（美國JohnsonJohnson公司，批號：216568）。

1.2方法

1.2.1實驗分組 將30只大鼠按隨機數字表法分為3組，每組10只：假手術組（S組，n=10）、CCD模型+DMSO組（T0組，n=10）、CCD模型+KG-501組（T1組，n=10）。

1.2.2鞘內給藥 鞘內給藥采用文獻[8]的方法，選擇L5～L6處刺入蛛網膜下腔，穿刺成功以出現典型鼠尾甩動為標準，按照分組要求將藥物注入鞘內，藥物總量均為30μL，于10s內注完。

1.2.3CCD模型的建立 大鼠腹腔注射戊巴比妥（50mg/kg）麻醉后，參照Xiao-ping Gu等[5]人的方法制備CCD模型。暴露左側L5椎間孔，使用不銹鋼22-G號鋼針，以鈍角輕而慢地插入L5椎間孔約4mm。當發現大鼠尾巴有小的抽搐時，將SURGIFLO？（60μl）緩慢地注入右側L5椎間孔。注射完畢后，肌肉和皮膚層使用6.0尼龍線縫合。假手術組采用同樣的操作步驟但不注射SURGIFLO？。縫合后立即腹腔注射抗生素（青霉素）10萬單位/只以預防感染。

1.2.4行為學測定 各組在造模前1d，造模后第4d、7d、10d、14d（t1-t5）、鞘內給藥后2h、4h、10h、12h、24h（t6-t10）檢測熱縮足反射潛伏期（Paw withdrawal thermal latency，PWTL）和機械性縮足反射閾值（Paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）。①熱縮足潛伏期：由儀器Plantar Test測定，參考Hargreaves等[10]行為學測試前7d，將大鼠置于底部為3mm厚玻璃板的透明有機玻璃箱內適應環境30min。初次使用前，調節紅外光源強度（IR），本實驗設定在IR=50，切斷時間（CUT-OFF）30s，防止組織損傷。當出現下肢的特征性甩動、提足或舔舐行為時，記錄時間。重復測定5次，每次間隔至少5min。②機械縮足閾值：通過儀器Dynamic Plantar Aesthesiometer測定，行為學測試前7d，將大鼠放入底部為金屬網格的有機玻璃箱（20cm×40cm×35cm）中，使其自由活動30min以適應環境。測試時，將金屬絲對準大鼠右側后足底中央下方，摁下開關，金屬絲向足底施加的壓力勻速增加（RMP設定為15s，即在15s內壓力勻速升至50g），當大鼠自發抬足的同時儀器自動記錄數值。機械縮足閾值的水平用克（g）表示，設定最大值為50g。重復測量5次，每次間隔至少1min。

1.3統計學分析 采用SPSS13.0統計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，組內比較采用重復測量設計的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

與t1時間點相比，S組在不同時間點PWTL和PWMT差異無統計學意義（P>0.05），T0組在t2-t10時間點PWTL縮短，PWMT降低（P<0.05）；與S組比較，T0組在t2-t10時間點PWTL縮短，PWMT降低（P<0.05）；與T0組比較，T1組在給藥后t7-t9時PWTL延長，PWMT升高（P<0.05），在t8時間點到達頂峰。見表1、2及圖1、2。

注：與t1時間點比較，aP<0.05；與S組比較，bP<0.05；與T0組相比，cP<0.05

注：與t1時間點比較，aP<0.05；與S組比較，bP<0.05；與T0組相比，cP<0.05

圖1 三組大鼠不同時間點PWTL（s）的比較，（n=10， ±s）

注：與t1時比較，aP<0.05；與S組比較，bP<0.05；與T0組相比，cP<0.05

注：與t1時間點比較，aP<0.05；與S組比較，bP<0.05；與T0組相比，cP<0.05

圖2 三組大鼠不同時間點PWMT（g）的比較，（n=10， x±s）

3討論

Xiao-ping Gu等人[5]的方法改良制備的對大鼠腰椎背根神經節的慢性壓迫模型，在探討根性疼痛機制和新治療手段方面是一個有用的工具。本模型模擬了神經病理性痛的病理生理過程，注射SURGIFLO？對脊髓背根神經節及鄰近神經根形成長時間穩定壓迫，使大鼠同側足底的熱刺激和機械刺激的痛敏閾值降低，出現痛覺過敏[5]。

本實驗結果顯示，與S組比較，T0組造模后t2-t5PWTL縮短，PWMT降低，提示模型制備成功。與給藥前比較，T0組給予對照溶劑DMSO，大鼠的痛行為學在實驗時間內無變化，提示DMSO對神經病理性痛無影響；進行CCD造模后14d給予鞘內注射給藥，與T0組比較，T1組給予KG-501后t7-t9時PWTL延長，PWMT升高。

神經元興奮去極化放電，導致Ca2+內流并引起Ca2+-鈣調蛋（CaM）進入細胞核內。細胞核內增加的Ca2+-CaM激活了鈣調蛋白激酶IV（CaMKIV），其可以磷酸化CREB的Ser133位點[9]。Ca2+流也可以激活延遲的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，導致了MAPK家族激酶的激活和進入胞核內，從而調節持續的CREB磷酸化[9]。CaMKIV也可能通過靶向于共激活物CBP來調節CREB[9]。Xue-song Song等人的研究表明，細胞外調節蛋白激酶（ERK）-CREB信號傳導通路參與神經病理性疼痛的形成與維持[6]。蛋白激酶A（PKA）磷酸化CREB的一個特定殘基Ser133 位點[10]。KG-501靶向于CREB包括精氨酸Arg-600在內的結合槽表面遠端，此殘基為CREB：CBP相互作用所必需[8]。小分子可通過抑制胞核內特殊的蛋白質-蛋白質間相互作用來干擾第二信使信號通路[8]。當KG-501加入到活細胞中，擾亂了CREB：CBP復合體的形成，并減弱了由于環磷腺苷（cAMP）的激動劑對靶基因的誘導作用[8]。

在本實驗條件下，本實驗結果表明，鞘內給予CREB抑制劑KG-501能夠有效地緩解改良CCD模型大鼠的痛覺過敏現象。但對其信號轉導通路的具體調控機制，還有待于進一步更深層次的研究。

參考文獻：

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[5]Xiaoping Gu，Liling Yang，Shuxing Wang，et al.A Rat Model of Radicular Pain Induced by Chronic Compression of Lumbar Dorsal Root Ganglion with SURGIFLO[J].Anesthesiology ，2008，108（1）：113-121.

[6]Marie K.Hoeger-Bement，Kathleen A.Sluka.Phosphorylation of CREB and Mechanical Hyperalgesia Is Reversed by Blockade of the cAMP Pathway in a Time-Dependent Manner after Repeated Intramuscular Acid Injections[J].The Journal of Neuroscience，2003，23（13）：5437-5445.

[7]Xue-song Song，Jun-li Cao，et al.Activation of ERK/CREB pathway in spinal cord contributes to chronic constrictive injury-induced neuropathic pain in rats[J].Acta Pharmacologica Sinica，2005，26：789-798.

[8]Jennifer L.Best，Carlos A.Amezcua，et al.Identification of small-molecule antagonists that inhibit an activator：coactivator interaction[J].PNAS December，2004，101（51）：17622-17627.

[9]Soren Impey，Richard H.Goodman[J].Science Signaling，2001，82（1）：1.

[12]薄靳華，顧小萍，孫曉鳳，等.鞘內注射CREB反義寡核苷酸對坐骨神經結扎小鼠疼痛行為的影響[J].中華行為醫學與腦科學雜志，2011（9）： 769-771.

編輯/王海靜