探討APC基因啟動子區甲基化狀態及其在宮頸癌發生發展中的意義

摘要：目的 研究與分析腺瘤性結腸息肉病基因啟動子區甲基化表現狀態及其在宮頸癌中發生及發展的作用及意義。方法 選取本院所收治的120例宮頸鱗癌患者及30例正常宮頸上皮組織進行研究，并采用甲基化特異性聚合酶鏈反應法檢測其組織中腺瘤性結腸息肉病基因啟動子區甲基化狀態，分析并比較。結果 經檢測發現，30例正常宮頸上皮組織中未檢測到腺瘤性結腸息肉病基因甲基化片段，而宮頸癌組織中，其腺瘤性結腸息肉病基因甲基化陽性率為65.0%（78/120）；兩組陽性率比較（P<0.05）。宮頸癌組織中，其不同臨床分期間腺瘤性結腸息肉病基因甲基化陽性率比較（P<0.05）；而不同組織學分級和是否淋巴結轉移間腺瘤性結腸息肉病基因甲基化陽性率比較（P>0.05）。結論 宮頸癌形成過程中，腺瘤性結腸息肉病基因啟動子區異常甲基化是早期且較為頻繁發生的事件，因此，其可能參與到宮頸癌的發生與發展中，進而為臨床疾病診斷及預后判斷提供重要的參考價值。

關鍵詞：腺瘤性結腸息肉病；宮頸癌；基因；甲基化

腺瘤性結腸息肉病（Adenomatous polyposis coli；APC）基因是人體中一種重要抑癌基因[1]。經相關研究發現[2]，腺瘤性結腸息肉病基因啟動子區甲基化變化與多種惡性腫瘤存在緊密聯系。然其甲基化變化與宮頸癌間的相關性研究報道較少[3]。本次研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應法檢測宮頸癌及正常宮頸組織中腺瘤性結腸息肉病基因啟動子區甲基化狀態情況，以探討與分析腺瘤性結腸息肉病基因與宮頸癌發生及發展的相關性，為臨床診斷及預防宮頸癌提供重要參考依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取貴陽市婦幼保健院婦科2011年6月～2014年10月所收治的120例宮頸鱗癌患者及30例正常宮頸上皮組織進行研究，本次研究標本均為手術切除或門診活檢所得新鮮標本。且所有組織均經病理學檢查證實，研究方案經醫院倫理委員會批準，患者自愿參與研究且簽署知情同意書。術前未采用任何方式對患者進行治療，患者術后資料完整，精神正常，可配合進行研究。宮頸癌組織中，年齡27～68歲，平均為（46.5±1.0）歲；臨床分期：I期54例、II期48例、III期+IV期18例；組織學分級：G1～G2為78例、G3為42例；病理類型均為宮頸鱗狀上皮細胞癌，淋巴結轉移者為26例、無淋巴結轉移者為94例。正常宮頸上皮組織中，年齡22～65歲，平均為（44.0±1.0）歲。

1.2方法 本次研究的新鮮組織在離體后立即放入液氮速凍，并轉入到-70℃冰箱中保存備用。試劑：酚、Proteinase K（Merck）、Taq DNA聚合酶、氯仿（Sigma）、dNTP、W izard DNA純化試劑盒（Genmed）、引物合成（上海生工）[4]。基因序列：APC甲基化：5-'TATTGCGGAGTGCGGGTC-3'、5-'TCGACGAACTCCCGACGA-3'；長度為98bp。APC非甲基化：5-'GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT-3'、5-'CCAATCAACAAACTCCCAACAA-3'；長度為108bp。DNA提取：選取新鮮組織100mg于液氮中碾碎，并采用蛋白酶K消化和苯酚-氯仿法進行抽取，同時采用乙醇沉淀法提取組織中DNA，最后采用TE緩沖液進行稀釋、溶解，再采用紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度，并放置于-20℃冰箱中保存以備用[5]。DNA的亞硫酸氫鹽修飾：取2ugDNA放置于EP管中，然后加入雙蒸水進行稀釋到50ul，并加入5.5ul新鮮配制的3.0mmol/L氫氧化鈉溶液，并搖勻，放置于37℃水浴中恒溫12min，再加入10mmol/L對苯二酚30ul、3.6mol/L亞硫酸鈉520ul，避光并混勻，待混勻后通過純化柱。使用W izard DNA純化回收系統提純DNA，加5.5ul新鮮配制的3mmol/L氫氧化鈉溶液，于37℃水浴中恒溫12min，再加入5mmol/L醋酸銨41ul，再使用無水乙醇沉淀DNA，并加入20ul雙蒸水進行溶解，并放置于-20℃冰箱中保存以備用。MSP反應：PCR反應體系（25ul）：10×PCR buffer 25.0ul 2.5mmol/LdNTP混合物4.0ulMgCL2、4.0ulTaq酶0.2ul。引物分別為1ul，模板DNA2ul；去離子水補齊到25ul。反應條件：95℃環境下預變性9min，95℃變性30s，退火[APC（M）：55℃、APC（U）：62℃]1min，72℃延伸30s，循環37次。72℃延伸5min，產物4℃保存。取10ul PCR反應產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并采用凝膠成像分析儀來采集圖像。

1.3結果判斷 甲基化引物擴增出現條帶，則判定為甲基化陽性；非甲基化引物擴增出現條帶，而甲基化未擴增出條帶，則判定為甲基化陰性。甲基化與非甲基化引物均擴增出現條帶，則判定為部分甲基化。

1.4統計學方法 數據采用SPSS20.0軟件統計與分析，計數資料采用[n（%）]表示，采用χ2檢驗。結果以P<0.05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1甲基化情況 經檢測發現，30例正常宮頸上皮組織中未檢測到腺瘤性結腸息肉病基因甲基化片段，而宮頸癌組織中，其腺瘤性結腸息肉病基因甲基化陽性率為65.0%（78/120）；2組陽性率比較（χ2=20.41，P<0.05）。見圖1。

圖1 不同宮頸組織中APC基因甲基化情況；A：正常宮頸上皮組織；B、C：宮頸鱗狀上皮細胞癌

2.2 APC基因甲基化與宮頸癌臨床病理因素間關系 臨床分期：I期54例、II期48例、III期+IV期18例；宮頸癌組織中，其臨床分期間腺瘤性結腸息肉病基因甲基化陽性率分別為74.1%（40/54）、45.8%（22/48）、88.9%（16/18）比較（P<0.05）；組織學分級：G1～G2為78例、G3為42例；而組織學分級陽性率分別為59.0%（46/78）、76.2%（32/42），2者比較（χ2=1.79，P>0.05）；淋巴結轉移與非淋巴結轉移陽性率分別為53.9%（14/26）、45.7%（43/94），兩者比較（χ2=1.57，P>0.05）。見表1。

3 討論

臨床上，大部分宮頸癌為鱗狀細胞癌，同時其也是婦科女性人群中常見癌癥死亡原因。經相關分子生物學研究發現，大約90%左右的宮頸癌患者伴有HPV感染，但大多數HPV感染患者并不會發展為宮頸癌，因此HPV感染為單一因素，其不足以導致人類宮頸正常細胞發生癌變。DNA甲基化是最早所發現的基因轉錄前調控途徑之一。然在真核生物基因組中，大約有80%CpG位點被甲基化，且這些甲基化主要發生于基因啟動子區域的CpG島。經相關研究表明，DNA甲基化可導致染色質結構和DNA構象及DNA穩定性、DNA與蛋白質相互作用方式發生變化，自身或結合甲基結合蛋白后，其將阻遏轉錄因子與啟動子的結合，最終可有效調控基因表達，同時其也是表觀遺傳學修飾最重要的基因轉錄前調控方式。抑癌基因的啟動子甲基化與某些腫瘤的臨床分期與病理類型存在緊密聯系，同時其也成為腫瘤分子診斷及預后判斷的重要生物標志物。基因啟動子甲基化作為基因水平的標志物，其具有極高特異性和靈敏度。近年來，經研究發現，與正常細胞相比，腫瘤細胞甲基化水平發生極大變化，且在腫瘤發生與發展過程中，時常出現整個基因組DNA的低甲基化和CpG島局部高甲基化。DNA的低甲基化往往因腫瘤細胞中DNA甲基化酶活性增高或CpG島的局部保護機制受到破壞而引起，最終導致染色體不穩定及原癌基因過度表達。而CpG島局部高甲基化常常會導致細胞凋亡基因和細胞周期調控基因及血管生成基因等癌相關基因的沉默，最終導致發生癌癥。

Wnt信號通路異常與多種腫瘤發生存在緊密聯系，其參與多種腫瘤發生的機制和信號傳導等。然APC是Wnt通路的構成蛋白之一，同時APC也是B-鏈蛋白（B-catenin）的負性調節因子，其可引發B-catenin在細胞中堆積，進而啟動一些新基因的表達，促使細胞生長發育和調控及凋亡等發生紊亂，最終導致癌變發生。經本次研究發現，經檢測發現，30例正常宮頸上皮組織中未檢測到腺瘤性結腸息肉病基因甲基化片段，而宮頸癌組織中，其腺瘤性結腸息肉病基因甲基化陽性率為65.0%（78/120）；兩組陽性率比較（P<0.05）；因此而說明APC基因啟動子區甲基化的發生可能具有一定腫瘤特異性。同時其還可能會成為診斷宮頸癌的分子標記物。宮頸癌組織中，其不同臨床分期間腺瘤性結腸息肉病基因甲基化陽性率比較（P<0.05）；而不同組織學分級和是否淋巴結轉移間腺瘤性結腸息肉病基因甲基化陽性率比較（P>0.05）；說明APC基因甲基化在人類宮頸癌發生中成為一種頻繁且早期發生的表觀遺傳學事件。APC基因甲基化可能參與到宮頸癌發生及發展過程中。正常宮頸組織沒有發生甲基化，因此而說明如可于癌變前及早實施相關及時而有效的干預，則可逆轉基因甲基化狀態。伴有淋巴結轉移的宮頸癌患者預后較差；本次研究發現，26例伴淋巴結轉移宮頸癌組織，其中14例存在甲基化片段。DNA甲基化可有效抑制腫瘤生長，臨床通過去甲基化制劑等方法來改變DNA甲基化狀態，進而可有效治療惡性腫瘤患者。本次研究中，不同臨床分期間腺瘤性結腸息肉病基因甲基化陽性率比較（P<0.05），因此而說明APC基因甲基化發生可能參與到宮頸癌進展中。臨床III/IV期甲基化率明顯高于臨床早期，臨床上宮頸癌III/IV期治療應首選化療治療，但效果并不理想，所以，臨床是否考慮選擇腫瘤生物靶向進行治療，以逆轉抑癌基因甲基化，進而提高臨床晚期癌癥治療效果。

綜上所述，APC基因啟動子區高甲基化是腫瘤發生過程中早期事件，因此臨床篩查APC基因甲基化狀態對宮頸癌早期診斷具有重要意義，進而可有效判斷患者預后。

參考文獻：

[1]袁衛平，吳飛翔，黃山，等.肝細胞癌中APC基因啟動子甲基化及蛋白表達的研究[J].現代腫瘤醫學，2010，18（9）：1795-1797.

[2]紀莎，瑪依努爾·尼牙孜.DNA甲基化與宮頸癌研究進展[J].中國優生與遺傳雜志，2014，22（3）：12-14+11.

[3]郭煒，董稚明，郭艷麗，等.賁門腺癌中轉化生長因子βII型受體基因啟動子區高甲基化及其與TGF-β1表達的相關性分析[J].腫瘤，2010，30（10）：875-880.

[4]孫勇，李運輝，張鵬.BRCA1基因啟動子區甲基化狀態抑癌作用研究[J].海南醫學，2014，25（12）：1717-1719.

[5]李文兵，余宗濤，何月，等.宮頸癌患者CHFR基因異常甲基化的檢測[J].湖北醫藥學院學報，2014，33（3）：253-255.編輯/哈濤