小型豬牙本質(zhì)掃描電子顯微鏡樣本制備與觀察及能譜分析

摘要：目的 介紹鈣化材料掃描電鏡的制備方法。方法 取小型豬牙齒標本，經(jīng)過固定，清洗，脫水，鍍膜，然后上鏡觀察。結(jié)果 在掃描電鏡下觀察取得了滿意的圖片和能譜信息。結(jié)論 通過科學的制備過程鈣化材料掃描電鏡顯微鏡取得良好的圖像信息。

關(guān)鍵詞：掃描電鏡顯微鏡；能譜儀；牙本質(zhì)

掃描電子顯微鏡由于具有分辨率高，放大倍率寬，三維立體成像好，樣品制備簡單等特點，在各個行業(yè)的得到了廣泛應(yīng)用。在醫(yī)學領(lǐng)域掃描電子顯微鏡主要用于樣品表面結(jié)構(gòu)的超微觀察以及通過掃描電子顯微鏡配套的能譜儀（EDS）檢測樣品出射的特征X射線，提供材料的化學成分的定性或定量分析結(jié)果。由于醫(yī)學材料具有質(zhì)地柔軟，容易變形，導電性能差，二次電子發(fā)射率低以及含水量多等特點，所以生物樣品的制備一直是實驗中的重點與難點。醫(yī)學材料主要分為：組織材料（舌，心，血管），鈣化材料（牙，骨），液體材料（血液，精子，卵子）。其差異性很大所以相對處理方法也各不相同。以小型豬牙本質(zhì)小管觀察為例，重點說一下鈣化材料的制備和觀察方法。

1實驗儀器

本次實驗需要用到萊卡公司的全自動臨界點干燥儀 CPD-300，日本電子公司的離子濺射儀JFC-1600，日本日立公司的掃描電子顯微鏡S-4800，日本HORIBA公司的X射線能譜儀 EX-350。

2樣品的預(yù)處理

2.1取樣 實驗采用3個月小型豬的牙齒。首先對小型豬麻醉取出牙齒，然后迅速放入液氮中。使其冷凍，變脆，用小錘輕敲，取其牙本質(zhì)斷面較平的直徑不超過5mm。高度3～5mm之間的樣品塊。

2.2樣品固定與清洗 將樣品顆粒放入濃度為2。5%（pH.7.2）中戊二醛中4°C低溫條件下固定2h。然后用0.1mol/L磷酸緩沖液反復(fù)清洗3次，10min/次。

2.3樣品的干燥 首先將樣品顆粒放入50%酒精中脫水10min，酒精濃度依次增加分別為 70%，80%，90%分別10min，最后使用100%酒精分2次各脫水15min。取出樣品放入CPD-300臨界點干燥儀中，采用預(yù)先設(shè)定好的骨質(zhì)樣品干燥流程90min。

2.4樣品的樣品臺固定 由于是固體大塊樣品采用銀膠粘合固定導電膠帶搭橋的方法，首先在樣品臺上涂上銀膠把樣品固定在銀膠上，讓樣品粘牢，冷卻5min使銀膠變?yōu)楣虘B(tài)。取兩條導電膠帶粘在樣品表面，注意不要觸碰需要觀察的部分。這樣固定既可以是樣品牢固的粘在樣品臺上，而且上下形成了電子通路從而減少得了樣品的放電現(xiàn)象，見圖1。

圖 1 樣品固體示意圖

2.5鍍膜 樣品呈不規(guī)則形大顆粒，需要對樣品反復(fù)鍍膜從而使金顆粒均勻的灑落在樣品表面，JFC-1600離子濺射儀采用電流為30，正面時間為40s，周圍四面為20s。這種噴金方法可以有效的抑制樣品的放電現(xiàn)象，金離子均勻的粘貼在樣品表面避免了遮擋要觀察的樣品表面。

2.6樣品觀察 針對不同材料的樣品以及觀察內(nèi)容的不同，觀察方法也不及相同。本次實驗采用2.0KV的低電壓，以及8.0mm高工作距離觀察。生物樣品觀察大小一般在500nm～1mm。所以工作距離不應(yīng)過于接近樣品。8.0mm工作距離即可以清楚的觀察到樣品表面又可以增加景深凸顯圖片的三維效果。低電壓有利于減少樣品的放電效果。 能譜觀察需要電鏡的高壓設(shè)為15kv，工作距離設(shè)為15mm。

3結(jié)果

3.1由于采用多種方法對樣品放電現(xiàn)象進行了抑制。圖像沒有出現(xiàn)放電現(xiàn)象。樣品的牙髓腔，牙髓神經(jīng)以及牙本質(zhì)小管都清晰可見，見圖2，圖3。

圖2 牙本質(zhì)包圍的牙髓腔與牙髓神經(jīng)

圖 3 牙本質(zhì)小管

3.2 對牙本質(zhì)進行了能譜元素分析，從分析結(jié)果來看牙本質(zhì)主要有元素鈣與磷構(gòu)成。其中鈣元素大概含有65%，磷元素大概含有35%，見圖4，圖5。

圖 4 樣品進行檢測的部位

圖5 樣品檢測結(jié)果

3.3 對牙本質(zhì)元素分布進行能譜分析，從而發(fā)現(xiàn)在牙本質(zhì)上鈣與磷均勻分布，而在牙髓腔中磷元素的分布大于鈣元素，見圖6。。

圖6 能譜下的鈣元素與磷元素分布

3討論

掃描電子顯微鏡作為觀察樣品超微結(jié)構(gòu)的重要工具其功能變得越來越強大，相對應(yīng)的樣品前期制備過程也在不斷的改進。其中制樣過程中固定、清洗、脫水，噴金這幾步是獲得清晰圖像的前提。隨著人們的不斷試驗和總結(jié)已經(jīng)形成了相對完善的試驗步驟。但還存在很多不足。比如：內(nèi)臟樣品制備，單個血小板的制備，小鼠耳蝸的觀察等等。都還需要人們不斷的摸索和總結(jié)。

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編輯/孫杰