熱處理對玉米象保護酶活性的影響

張會娜 呂建華 白旭光 劉淑麗

熱處理對玉米象保護酶活性的影響

張會娜 呂建華 白旭光 劉淑麗

（河南工業大學谷物資源轉化與利用省級重點實驗室，鄭州 450052）

分別以43、47、51、55℃對玉米象（SitophiLus zeamais）成蟲進行熱處理，測定不同處理時間后其超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性。在43、47℃的高溫處理條件下，保護酶活性存在應激性升高的階段，最大值分別達到13.49 U／mgSOD、0.39 U／mgPOD、4.20 mgH2O2／（min·mg）CAT，酶活性顯著增強，隨著處理時間的延長活性受到抑制。51、55℃高溫處理后，CAT活性均不高于對照水平，最低值僅為對照組的70%，SOD、POD活性在55℃處理不同時間后，明顯低于43、47、51℃處理后的酶活性。結果表明，玉米象成蟲體內3種酶活性與高溫處理溫度、處理時間有一定的相關性，升高溫度和延長高溫處理時間能導致保護酶活性降低。

熱處理 玉米象 SOD POD CAT

熱處理殺蟲是一種防治衛生害蟲及檢疫害蟲的有效方法，具有致死時間短、不產生抗性、無化學殘留等優點［1－2］。科學合理的熱處理不會損害糧食的品質，并且對糧食的加工品質具有一定改善作用［3－4］。目前熱處理已初步應用于檢疫害蟲和衛生害蟲的防治，在防治儲藏物害蟲方面也有一定的研究與應用［5］。在北美，熱處理已經廣泛應用于食品廠、面粉加工廠的害蟲除治，并得到美國環保局（EPA）、食品藥品監督局（FDA）的充分認可。當前對于熱處理殺蟲的研究報道主要集中于處理條件、處理效果等，而對于熱處理后害蟲的生理生化變化研究較少［6］。

昆蟲體內存在多種抗氧化酶，據報道［7－9］，SOD、POD、CAT 3種酶組成保護酶系統，能保證機體自由基代謝正常，維持昆蟲體內的生理活動正常進行。對昆蟲進行熱處理后，能引起昆蟲體內的保護酶系統調控機制的應答，在一定程度上保證昆蟲體內的生理活動正常進行。因此，昆蟲體內保護酶活性的變化可以作為昆蟲熱處理條件選擇的重要指標。

玉米象（S．zeamais）是全世界重要的儲藏物害蟲，而目前對玉米象的防治主要依靠化學防治方法。受害蟲抗藥性的增加、有效熏蒸劑減少等因素的影響，化學防治的效果面臨嚴峻挑戰。此外，環境保護理念的產生、綠色儲糧技術的應用也對儲藏物害蟲的防治方法提出新的要求［10］。因此，熱處理作為一種非化學防治方法，在替代化學防治方面具有較為廣闊的應用前景。目前，關于儲藏物害蟲在熱處理后，害蟲機體的保護酶調控機制還鮮有報道。本研究利用實驗室飼養的玉米象成蟲測定在不同的熱處理條件下，試蟲體內的保護酶活性變化，研究試蟲體內保護酶系統對高溫的應答，以期為科學合理實施熱處理殺蟲提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試昆蟲為河南工業大學儲藏物昆蟲實驗室飼養的玉米象，在溫度（28±1）℃、相對濕度（75±5）%的條件下以整粒小麥飼養，小麥使用前放入烘箱（60℃）中消毒2 h，調節含水量至（13±1）%，取羽化后1～2周的成蟲供試。

1.2 試驗處理

將玻璃瓶（直徑4 cm，高9.5 cm）置于恒溫水浴鍋中（保證水浸沒瓶身高度8 cm），將溫濕度計探頭置于玻璃瓶中心以測瓶內溫度，待達到設定溫度并穩定后快速接入20頭羽化后1～2周的玉米象成蟲（不分雌雄），用脫脂棉封口減少瓶內溫濕度與外界的傳遞。高溫處理條件設定為：43℃處理時間分別為165、205、245、285、325、365、405、445 min；47 ℃處理時間分別為10、20、30、40、50、60、70 和80 min；51 ℃處理時間分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 min；55 ℃ 處理時間分別為40、50、60、70、80、90、100、110 s。將試蟲在不同處理溫度下處理不同時間后快速取出，并在液氮中研磨制備酶液，重復3次。

1.3 酶活性測定

1.3.1 酶液的制備

參照李周直等［8］的方法并加以改進。取經過高溫處理的玉米象成蟲20頭，用PH 7.2的Tris－HCl緩沖液（內含1%的聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA）清洗干凈，液氮研磨，將研磨液轉入2.0 mL預冷的離心管中，用Tris－HCl緩沖液沖洗研缽后并入研磨液中，用緩沖液補充至2.0 mL，于0～4℃以11 000 r／min離心20 min，取上清液作為提取酶液，儲存于4℃冰箱中。

1.3.2 蛋白質的測定

參照Bradford［11］的考馬斯亮藍G－250方法測定酶液中蛋白質含量（以mg／mL表示）。

1.3.3 酶活性測定

SOD活性的測定參考馬志卿等［12］的鄰苯三酚法。總反應體系為2.2 mL H2O、25μL鄰苯三酚、2.25 mL PH 8.2的Tris－HCl緩沖液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA），50μL酶液，于波長為420 nm測定吸光度值，按公式計算SOD的活性。

SOD 活性（OD420／mg）＝ （OD1－ OD2）／（OD1×0.5×蛋白質含量）

式中：OD1為鄰苯三酚2 min吸光度；OD2為樣品所測吸光度。1個酶活單位（U）相當于4.525 mL反應液達到50%的抑制所需的酶量，酶活性以U／mg表示。

POD活性的測定參考Simon等［13］的愈創木酚法。反應混合液為2.0 mL PH 4.0的醋酸緩沖液、50 μL酶液、1.0 mL 0.05 mol／L 愈創木酚、1.0 mL 0.3 mol／L的H2O2，加入試管立即搖勻并迅速倒入比色皿中，于470 nm波長下比色，以蒸餾水調零，以緩沖液代替酶液作對照，記錄4 min后的吸光度值，酶活性以U／mg表示。

POD 活性（U／mg）＝OD1／t／蛋白質含量

式中：OD1為混合液470 nm的吸光度；t為反應時間／min。

CAT活性的測定參考楊蘭芳等［14］的標準曲線法。取A、B 2支試管，A為對照管，B為樣品管。在A中按順序加入1.5 mL PH 7.8 Tris－HCl緩沖溶液（內含1%的聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA）、0.1 mL 酶液、1.4 mL H2O、1.0 mL 8%H2SO4。B管里依次加1.5 mL Tris－HCl緩沖溶液、0.1 mL酶液、1.1 mL H2O，0.3 mL 0.3mol／L 的H2O2，搖勻，反應3 min后加入1.0 mL 8%H2SO4終止反應。用A管調零，在波長為240 nm處測定樣品管的吸光度，酶活性以每分鐘每毫克蛋白質消耗H2O2毫克數計。

式中：A2為對照的吸光度；A1為樣品的吸光度；t為反應時間／min；a、b為標準曲線回歸方程中的常數。

1.4 數據處理與分析

數據采用Microsoft Excel 2010、SAS 9.0軟件進行方差分析，采用Duncan's新復極差法進行多重比較，檢驗試驗結果的可信度以及各處理間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 43℃高溫處理對玉米象酶活性的影響

43℃高溫處理對玉米象保護酶活性的影響如表1所示。由表1可知，在整個高溫處理過程中，隨著高溫處理時間的延長，SOD活性升高后降低，POD活性逐漸降低，CAT活性則呈現降低－升高－降低的趨勢。SOD、POD活性在高溫處理時間不高于245 min時變化不大，方差分析表明酶活性無顯著性差異（P＞0.05）。在高溫處理時間為285 min時SOD活性在達到峰值，約是對照組的1.16倍，POD和CAT活性則在325 min時達到最大，但與對照組無顯著性差異（P＞0.05），之后隨著時間的延長3種保護酶活性降低，表現為抑制作用。

表1 43℃高溫處理對玉米象體內保護酶活性的影響

2.2 47℃高溫處理對玉米象酶活性的影響

由表2可以看出，在47℃高溫處理條件下，隨著處理時間的延長，玉米象的POD、CAT活性呈現先下降又上升再下降的趨勢，SOD活性則隨著處理時間延長升高后降低。SOD活性達到峰值的時間較43℃處理時短，在處理時間為20 min時即達到了13.49 U／mg，活性在短時間內得到了增強，且整個處理過程中活性都比對照組高。POD活性在高溫處理時間為80 min時被明顯抑制，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。CAT活性在處理時間為60 min時顯著增強，活性值高出對照組0.39 mgH2O2／（min·mg），表明適當提高處理時間對CAT活性起激活作用。

表2 47℃高溫處理對玉米象體內保護酶活性的影響

2.3 51℃高溫處理對玉米象酶活性的影響

玉米象經51℃高溫處理后，隨著高溫處理時間的延長，SOD、POD活性先升高后降低，CAT活性逐漸下降。SOD在整個處理時間段活性均高于對照組，但只有處理時間為3、3.5 min時的活性與對照存在顯著性差異（P＜0.05）。POD活性在2.5、3 min時達到峰值，之后隨著處理時間的延長活性逐漸被抑制。51℃高溫短時處理對CAT活性影響較小，表現為處理時間不大于5 min時，不同處理時間之間酶活性無顯著性差異（P＞0.05），在高溫處理時間為5.5 min時CAT活性顯著下降，表現為抑制作用。

表3 51℃高溫處理對玉米象體內保護酶活性

2.4 55℃高溫處理對玉米象酶活性的影響

在55℃高溫處理條件下，玉米象體內SOD活性隨著處理時間的延長而上升，POD和CAT活性則隨著處理時間的延長先下降后又上升。SOD在處理時間低于70 s時、POD和CAT在整個處理時間段內，其活性均低于對照組，表現為抑制作用。POD和CAT活性分別在處理時間為60、70 s時到達最低值，分別為0.25 U／mg 和2.64 mgH2O2／（min·mg），顯著低于對照組（P＜0.05）。

表4 55℃高溫處理對玉米象體內保護酶活性

3 討論與結論

昆蟲處于逆境環境，體內活性氧增加，而SOD、POD和CAT這3種酶組成的防御系統能維持自由基代謝的穩定［15］。因此，保護酶活性的大小可以影響昆蟲的耐受高溫脅迫的能力。

玉米象的保護酶活性與處理的溫度、時間有一定的相關性。溫度是影響SOD活性的重要因素，適度升高溫度能增加SOD的活性，但溫度過高則產生抑制作用。55℃高溫處理不同時間后，POD和CAT活性受到抑制。溫度相同時，保護酶活性受處理時間的影響顯著，整體上保護酶活性在高溫處理的最后階段均顯著降低。由研究結果可知，提高處理溫度或延長處理時間能抑制保護酶活性，55℃高溫處理玉米象能使保護酶活性在短時間內降低，可作為快速致死害蟲的有效溫度。

昆蟲體內除SOD、CAT和POD組成的保護酶系統維持的自由基代謝平衡外，還有谷胱甘肽轉移酶（GSH），多功能氧化酶（MFO）等，這些自由基代謝酶系在熱處理時對昆蟲生理生化的調控作用，則有待進一步研究［16－18］。

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Effect of Heat Treatment on the Activities of Protective Enzymes in Sitophilus Zeamais

Zhang Huina Lü Jianhua Bai Xuguang Liu Shuli
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052）

The adults of Sitophilus zeamais were treated for a series of times in laboratory under 43，47，51 ℃and 55 ℃ respectively.The activities of superoxide dismutase（SOD），peroxidase（POD）and catalase（CAT）in S．zeamais adults were determined after heat treatment.Irritability increase stage was observed in activities of protective enzymes when high temperature treatment under 43，47 ℃，with the maximum value being 13.49 U／mg（SOD），0.39 U／mg（POD），4.20 mg H2O2／（min·mg）（CAT）respectively.The activities of enzymes were enhanced significantly and then restricted with the extension of time.The activity of CAT was lower than the control after high temperature under 51，55 ℃，the lowest was only 70%of that in the control.The activities of SOD and POD were lower than that in 43，47，51 ℃ after high temperature under 51，55 ℃.Analysis showed that the activities of three protective enzymes of S．zeamais adults had a certain relationship with the treatment temperatures and treatment times.Improving temperature and prolonging heat treatment time could result in lower activity of protective enzyme.

heat treatment，Sitophilus zeamais，SOD，POD，CAT

TQ646

A

1003－0174（2016）08－0090－05

863計劃（2012AA101705－2），河南省基礎與前沿技術研究（152300410078），谷物資源轉化與利用省級重點實驗室開放課題（001255）

2014－12－11

張會娜，女，1989年出生，碩士，儲糧害蟲綜合治理與安全儲糧技術

呂建華，男，1971年出生，副教授，儲糧害蟲綜合治理與安全儲糧技術