大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的富集分離研究

王昱婷 王笑宇 許 晶

大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的富集分離研究

王昱婷 王笑宇 許 晶

（東北農業大學理學院，哈爾濱 150030）

以低溫脫脂豆粕為原料，采用優化Nagano法分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白。本文系統考察提取過程中多個單因素對分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質含量和提取率的影響。并根據單因素試驗結果設計響應面試驗，對浸提溫度、浸提pH、沉淀劑用量進行優化，分別確定高提取率大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的分離條件。試驗結果表明：大豆球蛋白的最佳提取條件為浸提溫度44.4℃，浸提pH 8.5，CaCl220 mmol／L，提取率64.14%，純度83.6%；β－伴大豆球蛋白的最佳提取條件為浸提溫度49.5℃，浸提pH 8.6，CaCl20.00 mmol／L，提取率40.15%，純度82.9%。

大豆球蛋白 β－伴大豆球蛋白 富集 分離

大豆蛋白作為一種重要的植物蛋白，具有優良的功能性質和較高的營養價值，被廣泛應用于食品工業中。按照沉降模式，大豆蛋白可分為4個主要的組分：2S、7S、11S 和15S［1－2］，其中11S 的成分是大豆球蛋白，即11S球蛋白；7S的主要成分是β－伴大豆球蛋白，即7S球蛋白。大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白二者結構不同，在理化性質、營養價值和功能特性方面均有很大差異［3］。因此，如何從大豆蛋白中高效分離這兩種組分是研究者關注的重點。

目前，Thanh 法［4］、Saio 法［5］和Nagano 法［6］是分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的3種主要方法。在這3 種方法的基礎上，王孝英等［7］、段春紅等［8］、朱曉燁等［9］、姜劍等［10］、宋佳等［11］不斷改進和完善試驗方法，簡化了分離步驟，提高了產品的純度。但結合Thanh法、Saio法、Nagano法3種經典方法，在保證一定蛋白質含量的基礎上，單獨的分別確定大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白高提取率的系統優化鮮見報道。

本研究采用優化Nagano法分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白，基于Thanh法和Saio法加入沉淀劑，系統考察浸提溫度、浸提pH、沉淀劑用量對分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質含量和提取率的影響。在保證一定蛋白質含量的基礎上，根據單因素試驗結果設計響應面試驗，對浸提溫度、浸提pH、沉淀劑用量進行優化，為分別得到高收率的大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的分離方法提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕：哈高科；NaOH、SBS（NaHSO3）、NaCl、HCl、電泳試劑盒、Tris 堿、甘氨酸、SDS（十二烷基硫酸鈉）、考馬斯亮蘭R250、冰乙酸、甲醇、溴酚藍、DTT、硫酸銅（CuSO4）、硫酸鉀（K2SO4）、濃硫酸（H2SO4）、硼酸、碳酸鈉、甲基紅、溴甲酚綠，均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW100型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；HSY2－SP電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器廠；ZD－2型自動電位滴定儀：上海精密科學儀器有限公司；LNK－872型多功能快速消化器：江蘇省宜興市科教儀器研究所制造；自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫脂大豆粉的制備

將低溫脫脂大豆粕經高速萬能粉碎機粉碎，過50目篩，得低溫脫脂大豆粉。

1.3.2 大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的分離方法

采用優化Nagano法［6］分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白，分離流程圖見圖1。

圖1 大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白分離流程圖

蛋白提取率＝（凍干粉中蛋白含量×凍干粉質量）／（脫脂豆粉中的蛋白含量×脫脂豆粉質量）×100%

1.3.3 單因素試驗

通過3組單因素試驗考察浸提溫度（25、35、45、55、65 ℃）、浸提pH（8.0、8.5、9.0）、沉淀劑用量（0、5、10、20、30 mmol／L）對分離大豆球蛋白和β － 伴大豆球蛋白的蛋白質含量及提取率的影響。

1.3.4 響應面試驗

根據單因素試驗的結果，采用響應面分析以浸提溫度、浸提pH、沉淀劑用量為試驗因素，分別以大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白提取率為指標，設計三因素三水平的Box－Behnken試驗。

表1 響應面試驗因素水平表

1.3.5 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分析

根據Laemmli法［12］的SDS－PAGE 不連續電泳方法，分別配制5%的分離膠，12%的濃縮膠，上樣量為10μL。開始電泳時電壓為80 V，樣品到達分離膠后改為120 V，電泳結束后，取出膠片用考馬斯亮藍R－250染色，然后用甲醇／冰醋酸脫色后對電泳圖譜進行分析。

1.3.6 結果分析

根據凱氏定氮法［13］進行蛋白質含量分析，采用BandScan 5.0軟件進行SDS－PAGE分離效果和蛋白組分純度分析，采用Microsoft Office Excel 2007和Design－Expert 8.0.6軟件進行統計分析。

2 結果討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 浸提溫度的確定

較高的溫度有利于蛋白溶出，但過高的溫度又會造成蛋白變性。Riblett等［2］報道大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的最初變性溫度接近82℃和68℃。因此本試驗浸提溫度選擇25～65℃。隨著溫度升高大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質含量和提取率先增加后減少（除65℃ β－伴大豆球蛋白提取率），在45℃時最高。65℃ β－伴大豆球蛋白提取率又出現上升，這可能是由于浸提溫度升高蛋白質變性并產生熱聚集導致的。

表2 浸提溫度對大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質含量及提取率的影響

2.1.2 浸提pH的確定

Than法的浸提pH是8.0。但大豆球蛋白的基本亞基的等電點是8.0～8.5，較低的pH值（低于8.0）對于基本亞基的提取是不利的［14］。因此，進一步考察浸提pH是必要的，試驗結果見表3。在pH 8.5的條件下提取大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質含量和提取率最高，選擇浸提pH 8.5。

表3 浸提pH對大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質含量及提取率的影響

2.1.3 沉淀劑用量的確定

鈣鹽沉淀法［15］可用于提取大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白，試驗考查了0～30 mmol／L CaCl2沉淀劑對提取結果的影響，試驗結果見表4。隨著沉淀劑用量的增加，大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質含量下降，且分別保證在80%和65%以上，可以用于一定的性質測定；但大豆球蛋白的提取率從0～10 mmol／L CaCl2明顯增加，然后10 ～ 30 mmol／L CaCl2趨于平緩，β－伴大豆球蛋白的提取率隨之從0 ～10 mmol／L CaCl2明顯下降，這與Zi等［16］研究結論一致，然后10～30 mmol／L CaCl2趨于平緩。因此，10 mmol／L CaCl2沉淀劑的加入與否對大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的提取率有很大影響。

表4 沉淀劑用量對大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的蛋白質含量及提取率的影響

2.2 大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白提取率的響應面分析

響應面試驗設計方案及試驗結果見表5。

表5 大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白提取率的響應面設計與試驗結果

使用Design－Expert 8.0.6軟件對所得試驗數據進行回歸分析，可以得到如下的回歸方程：

大豆球蛋白＝54．45 －0．93A －0．75B ＋19．52C －0．20AB ＋0．24AC ＋0．58BC －5．79A2－4．87B2－8．58C2

β－伴大豆球蛋白＝6．94＋0．75A＋0．31B －17．58C ＋0．035AB － 0．74AC － 0．47BC － 1．67A2－1．63B2＋15．19C2

對試驗數據進行方差分析，分析結果見表6。大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白模型P＞F小于0.000 1，說明該模型是極顯著的。此外在模型中的其他參數A、B、C、BC、A2、B2、C2都是顯著的（P ＞ F 小于0.05）。模型失擬項Lack of Fit（P ＞F 大于0.05），說明模型失擬項是不顯著的，結果表明該模型選擇合適；相關系數均大于0.9，說明模型擬合程度良好；大豆球蛋白模型的變異系數為1.04，β－伴大豆球蛋白模型的變異系數為4.42，表示所得的模型方程可以反映真實的試驗值。通過上述分析，可知能用該模型來分析大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白提取率的變化。

經過表6的回歸分析，可以得出浸提溫度A、浸提pH B、沉淀劑加入量C三因素對考察指標交互作用影響，采用響應面分析法，得到大豆球蛋白預測的最佳提取條件為浸提溫度44.41℃，浸提pH 8.49，CaCl220 mmol／L，提取率65.42%；β－伴大豆球蛋白預測的最佳提取條件為浸提溫度49.51℃，浸提pH 8.62，CaCl20.00 mmol／L，提取率40.15%。由于表5響應面設計中，不包含分析得到的最佳提取條件，需要檢驗響應面法所得結果的可靠性。本試驗結合實際操作情況，根據優化條件對大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白提取條件進行修正，大豆球蛋白提取條件修正為浸提溫度44.4℃，浸提pH8.5，CaCl2

20 mmol／L，β－伴大豆球蛋白提取條件修正為浸提溫度49.5 ℃，浸提pH 8.6，CaCl20.00 mmol／L，然后進行提取測得大豆球蛋白蛋白質量分數81.64%，提取率為64.14%，β－伴大豆球蛋白蛋白質量分數86.84%，提取率為40.15%，與回歸方程預測值基本吻合，表明模型是合理有效的。

表6 大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白響應面方差分析

表6 （續）

2.3 不同方法分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白效果的比較

SDS－PAGE凝膠電泳技術測定Saio法、Thanh法、Nagano法、優化Nagano法分離出大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白，比較蛋白分離效果和純度，其SDS－PAGE圖見圖2。根據電泳圖譜，用凝膠分析軟件（BandScan5.0）對SDS－PAGE電泳圖像中的條帶進行含量分析，分析結果列于表7。

圖2 不同方法分離大豆球蛋白β－伴大豆球蛋白電泳圖

4種方法的大豆球蛋白組分和β－伴大豆球蛋白組分亞基組成和含量不同。由圖3、表7可知，Saio法分離的β－伴大豆球蛋白組分與大豆球蛋白組分并未完全分開，而Thanh法分離效果較好，Nagano方法分離效果最好，純度更高，本試驗優化后方法，大豆球蛋白分離純度沒有Nagano高，這可能是由于沉淀劑CaCl2的加入，但在蛋白質含量和大豆球蛋白分段含量一定下，提取率較高，可以用于后續性質測定。

結果統計表明，該大豆球蛋白組分中大豆球蛋白純度為83.6%，β－伴大豆球蛋白組分中β－伴大豆球蛋白純度82.9%。采用優化Nagano法分離大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白得到樣品的純度較高，基本達到了預期的效果。

3 結論

本研究在Thanh法、Saio法和Nagano法3種提取大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的主要方法基礎上，通過單因素試驗和響應面試驗優化了大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的分離方法，優化的Nagano法提高了大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白的提取率（大豆球蛋白可達64.14%和β－伴大豆球蛋白可達40.15%），且純度為大豆球蛋白83.6%和β－伴大豆球蛋白82.9%，為進一步的實際生產提供了參考。

表7 大豆球蛋白中亞基含量分析

［1］Mujoo R，Trinh D T，Ng P K W.Characterization of storage proteins in different soybean varieties and their relationship to tofu yield and texture［J］.Food Chemistry，2003，82：265 －273

［2］Riblett R C，HeraldT J，Schmidt K A，et al.Characterization ofβ－conglycinin and glycinin soy protein fractions from four selected soybean genotypes［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49：4983 －4989

［3］Utsumi S，Kinsella J E.Structure － function relationship in food proteins，subunit interactions in heat－ induced gelation of 7S，11S，and soy isolate proteins［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1985，33：297 －303

［4］Thanh V H，Shibasaki K.Major proteins of soybean seeds.A straightforward fraction and their characterization［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1976，24：1117 －1121

［5］Saio K，Watanabe T.Food use of soybean 7Sand 11Sproteins（extraction and functional properties of their fractions）［J］.Journal of Food Science，1973，38（7）：1139 －1145

［6］Nagano T，Hirotsuka M，Mori H.Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin from soybeans［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40：941 －944

［7］王孝英，張雪旺，劉漢靈.7S和11S大豆球蛋白的分離研究［J］.中國食品添加劑，2006，32（3）：74 －77，43

Wang Xiaoying，Zhang Xuewang，Liu Hanling.Studies on the separation of 7Sand 11Sglobulin in soybean protein［J］.China Food Additives，2006，32（3）：74 －77，43

［8］段春紅，孫婉，姚曉琳，等.Thanh法提取7S、11S球蛋白功能特性的研究［J］.食品工業科技，2011，32（7）：79 －82

Duan Chunhong，Sun Wan，Zhao Xiaolin，et al.Study on functional properties of 7S and11S globulin extracted by Thanh method［J］.Science and Technology of Food Industry，2011，32（7）：79 －82

［9］朱曉燁，遲玉杰，劉紅玉.大豆蛋白7S和11S組分分離方法的優化［J］.食品工業科技，2011，32（7）：267 －269

Zhu Xiaoye，Chi Yujie，Liu Hongyu.Optimization of separation method of 7S and 11S in soy protein［J］.Science and Technology of Food Industry，2011，32（7）：267 －269

［10］姜劍，遲玉杰，孫艷梅，等.分離β－伴大豆球蛋白和大豆球蛋白工藝研究［J］.食品科學，2011，32（6）：11 －15

Jiang Jian，Chi Yujie，Sun Yanmei，et al.An Investigation into the Separation Process forβ－Conglycinin and Glycinin［J］.Food Science，2011，32（6）：11 －15

［11］宋佳，陳野，鄭曉晨，等.大豆11S和7S球蛋白提取工藝優化研究［J］.食品研究與開發，2013，34（2）：77 －81

Song Jia，Chen Ye，Zheng Xiaochen，et al.Study on Extraction Process Optimization of Soybean 11 Sand 7 SGlobulin［J］.Food Research and Development，2013，34（2）：77 －81

［12］Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，227：680 －685

［13］AACC.Crude protein － micro Kjeldhal method.In approved methods of the AACC（Vol－ II，10th ed.）.2000，AACC method，46 －13

［14］Silvana P，Maria C A.Soy protein isolate components and their interactions［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，43：1762 －1767

［15］郭慶啟，張娜，趙新淮.基于鈣離子誘導的大豆蛋白分級技術［J］.農業機械學報，2009，40（11）：161 －164

Guo Qingqi，Zhang Na，Zhao Xinhuai.Fractionation of soybean proteins based on technique of Ca2＋inducedprecipitation［J］.Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery，2009，40（11）：161 －164

［16］Zi T，Liu X Q，Lin L.Fractionation of soybean globulins using Ca2＋and Mg2＋：a comparative analysis［J］.Journal of the American Oil Chemists Society，2009，86：409 －417.

Enrichment and Separation Study on Glycinin and β－conglycinin

Wang Yuting Wang Xiaoyu Xu Jing
（College of Science，Northeast Agricultural University，Haerbin 150030）

Based on low － temperature defatted soybean meal as raw material，this paper adopted the method of optimization of Nagano for separation of glycinin andβ－conglycin.This paper studied effect of the multiple single factors on protein content and extraction yield of glycinin andβ－conglycin in the process of extraction.According to the results of single factor experiment，we designed response surface experiments，and the extraction temperature，extraction pH and amount of precipitant were optimized.We had respectively determined the separation conditions for glycinin andβ－conglycin with high extraction yield.The experimental results showed that the optimum extraction conditions of glycinin were extraction temperature of 44.4 ℃，extraction pH of 8.5，CaCl220 mmol／L，the extraction yield of 64.14%and purity of 83.6%；the optimum extraction conditions of ptionglycin were extraction temperature of 49.5 ℃，extraction pH of 8.6，CaCl20.00 mmol／L，the extraction yield of 40.15%and purity of 82.9%.

glycinin，β － conglycin，enrichment，separation

TS209

A

1003－0174（2016）08－0024－06

國家自然科學基金（31301600），中國博士后特別資助（2014T70306），哈爾濱市應用技術研究與開發項目（2014RFQXJ123），黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12541008）

2014－12－11

王昱婷，女，1989年出生，碩士，植物蛋白工程

許晶，女，1979年出生，副教授，糧食、油脂與植物蛋白工程