胃癌中Notch1、DLL4和HES1的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

·論著·

胃癌中Notch1、DLL4和HES1的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

何黎黎張富花張錦華莊劍波張建剛韓儉

摘要：目的通過檢測Notch信號系統中的Notch1、DLL4和HES1蛋白在胃癌組織中的表達，分析它們與患者臨床病理特征及生存期之間的關系，探索胃癌發生發展的機制。方法 將胃癌、癌旁組織制作組織芯片，采用免疫組化法檢測Notch1、DLL4和HES1的表達，隨訪患者，分析它們的表達與患者臨床病理特征及生存期之間的關系。結果Notch1在胃癌、癌旁及對照組中的表達陽性率分別為48.30%、25.00%和16.67%，三者間差異有統計學意義(P<0.05)；Notch1的表達陽性率在有淋巴結轉移組中為41.3%，顯著低于無淋巴結轉移組(61.28%，P<0.05)；在其他病理特征間Notch1表達差異均無統計學意義(P>0.05)。DLL4在胃癌、癌旁和對照組中的表達陽性率分別為55.94%、45.7%和56.67%，三者間差異無統計學意義(P>0.05)；在不同病理特征間DLL4的表達差異均無統計學意義(P>0.05)。HES1在胃癌、癌旁和對照組中的表達陽性率分別為36.64%、34.40%和33.3%，三者間差異無統計學意義(P>0.05)；HES1在低分化胃癌中的表達陽性率為51.43%，高于高/中分化組(31.25%，P<0.05)；在其他病理特征間HES1的表達差異均無統計學意義(P>0.05)。Notch1、DLL4和HES1陽性組和陰性組生存期之間差異無統計學意義(P>0.05)。結論胃癌組織中Notch1呈高表達，可作為胃癌診斷和治療的靶點；Notch1的表達與胃癌淋巴結轉移呈負相關；HES1在低分化胃癌中表達升高，可能是胃癌分化程度的一個標志物。

關鍵詞：胃癌；Notch1；DLL4；HES1；臨床病理特征；生存期

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2015.02.018

基金項目：甘肅省科技支撐計劃(1011FKCA120)

收稿日期：(2014-07-20)

作者單位：730000蘭州大學病原生物學研究所，甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室(何黎黎，韓儉)；730000甘肅蘭州，甘肅省第二人民醫院消化科(張富花，張錦華，莊劍波)；730000蘭州大學病理學研究所(張建剛)

通信作者：韓儉，Email: hanj@lzu.edu.cn

Relationship between Notch1, DLL4 and HES1 expression and clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancerHELi-li,HANJian.DepartmentofPathogenicBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,KeyLabofPreclinicalStudyofNewDrugsofGansuProvince,LanzhouUniversity,Lanzhou(730000),China.ZHANGFu-hua,ZHANGJin-hua,ZHUANGJian-bo.DepartmentofGastroenterology,SecondPeople′sHospitalofGansuProvince,Lanzhou(730000),China.ZHANGJian-gang.DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,LanzhouUniversity,Lanzhou(730000),China

Abstract：ObjectiveThis paper detected Notch signaling components--Notch1, DLL4 and HES1 expression in the gastric cancer and follow-up patients survival in order to analyze their relationship with clinicopathological characteristics and survival, and to explore the mechanism of gastric cancer development. MethodsGastric cancer and paracancerous tissue cases were used to manufacture tissue microarray. Immunohistochemistry was used to detect Notch1, DLL4 and HES1 expression. Patients′ survival time were followed up. The relationship between Notch1, DLL4 and HES1 expression and clinicopathological characteristics, and survival of patients were analyzed. ResultsThe Notch1 positive rate in the gastric cancer, paracancerous tissue, and control group was 48.30%, 25.00% and 16.67%, and the expression of gastric cancer group was significantly higher than that of other groups (P<0.05). The positive rate in the gastric cancer with lymph node metastasis group (41.3%) was significantly lower than that without lymph node metastasis group (61.28%) (P<0.05). The DLL4 positive rate in the gastric cancer, paracancerous tissue, and control group was 55.94%, 45.7% and 56.67% respectively, there was no significant difference between different groups (P>0.05). The HES1 positive rate in the gastric cancer, paracancerous tissue, and control group was 36.64%, 34.40% and 33.3%, and there was no significant difference between different groups (P>0.05). The HES1 positive rate (51.43%) in poorly differentiated gastric cancer was significantly higher than that in the high/middle differentiation group (P<0.05). There was no relationship between Notch1, DLL4 and HES1 expression and the patients′ survival time (P>0.05). ConclusionsGastric cancer tissues showed high expression of Notch1 which can be used as a target for gastric cancer diagnosis and treatment. Notch1 expression was negatively correlated with lymph node metastasis. HES1 expression increased in poorly differentiated gastric cancer, which may be act as an indicator of the degree of differentiation.

Key words：Gastric cancer; Notch1; DLL4; HES1; Clinicopathologic characteristic; Survival

胃癌是全球常見和高致死率的惡性腫瘤之一，2011年大約有738 000人死于胃癌[1]。胃癌的形成是多因素作用的結果。正常機體胃黏膜上皮細胞的增殖與凋亡之間的動態平衡依賴于體內多種細胞信號轉導途徑的精細調節，一旦平衡被破壞，細胞正常的增殖、凋亡等生物學行為會發生紊亂，導致細胞異常增生、分化，甚至發生腫瘤。在腫瘤發展過程中，細胞信號轉導途徑參與改變細胞黏附性、基質降解、新生血管和淋巴管形成以及逃逸機體免疫等多個環節，共同協助腫瘤持續增殖、浸潤及轉移。

Notch信號通路是干細胞形成信號網絡中非常重要的一步，對細胞的分化、增殖和凋亡具有廣泛的調控作用，與腫瘤發生發展有密切關系[2]。研究發現，Notch信號通路的配體DLL4在調控血管的萌發和分支形態中扮演著重要的角色[3]。Notch信號的下游基因HES1與成骨肉瘤細胞的轉移能力有關[4]。本研究通過應用組織芯片，檢測Notch 信號通路中Notch1、DLL4和HES1蛋白在胃癌、癌旁及淋巴結中的表達情況，分析其表達與患者病理特征的關系以及對患者生存期和預后的影響，有助于進一步探討胃癌發生發展的分子機制。

1資料與方法

1.1　 研究對象

本研究選取1999年至2004年甘肅武威腫瘤醫院的胃癌患者的術后石蠟標本，共192例胃癌組織及56例癌旁組織 (取材距癌組織邊緣>60 mm)。所有患者均有詳細的臨床資料和手術紀錄，術前均未行化學治療、放射治療。胃癌患者中男15l例、女41例，年齡30～73歲，中位年齡55歲。病變局限于黏膜和肌層內5l例(其中黏膜層8例)，浸及漿膜或漿膜外141例；有淋巴結轉移116例，無淋巴結轉移76例；低分化癌99例，中分化癌45例，高分化癌48例；腸型96例，彌漫型84例，混合型12例。取30例當地同期胃鏡檢查無癌變患者的胃黏膜作對照。所有標本均征得患者同意及醫院倫理委員會批準。

1.2　試劑

SP-9000及DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Notch1、DLL4、HES1多克隆抗體(香港Abcam，按說明書稀釋，稀釋度分別為：Notch1 1∶200，DLL4 1∶50，HES1 1∶100)。用已知陽性片作為陽性對照(由所購試劑公司提供)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.3　方法

1.3.1組織芯片制備制作空白模具蠟塊，打出6×7個間距為1 mm、直徑為2 mm的孔。標本常規蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察選取1個代表性位點，采集直徑為2 mm的組織芯放入模具蠟塊相應孔內，左上角兩孔用鼠組織定位。石蠟包埋，制成組織芯片。

1.3.2免疫組化染色依照試劑說明書，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法對Notch1、DLL4和HES1進行染色檢測。凡染色過程中掉片者被淘汰。

1.3.3結果判斷參照Masunaga等[5]的方法，對Notch1、DLL4和HES1染色結果進行半定量評分：根據組織細胞的染色范圍，陽性細胞數<5%、5%～25%、26%～50%、>50%以上分別計為0、1、2、3分； 根據陽性細胞的染色強度，按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別判定為-、+/-、+、++，即0、1、2、3分。最后依據兩項計分之和來綜合判斷，≥3分者為陽性，≤2分者為陰性。

1.4　隨訪及統計學分析

采用電話、上門詢問等方法對192例患者進行隨訪，有111 例獲得隨訪，隨訪時間為術后6～79個月。采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料用成組設計t檢驗，并進行Spearman等級相關分析，計數資料采用χ2檢驗，生存分析用Kaplan-Meier曲線，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1　 Notch1、DLL4和HES1在不同組織中的表達情況

組織芯片經過免疫組化染色后，可見Notch1主要在細胞質表達，少數在細胞核表達，呈淡黃色或棕黃色或棕褐色(見圖1a)。Notch1在胃癌、癌旁及對照組中的表達陽性率分別為48.30%、25.00%和16.67%，胃癌組陽性率顯著高于癌旁組織及對照組，三者間差異有統計學意義(P<0.05)，其中胃癌組顯著高于癌旁組(P<0.05)和對照組(P<0.05)。見表1。

表1　Notch1在不同病理組織中的表達情況

注：與癌旁組織和對照組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP>0.05

正常組織中，DLL4主要在細胞膜表達，在異型增生和癌組織中則表達在細胞質(見圖1b)。DLL4在胃癌、癌旁組織和對照組中的表達陽性率分別為55.94%(80/143)、45.7%(16/35)和56.67%(17/13)，三者間差異無統計學意義(χ2=1.263，P=0.532)。

HES1主要在細胞質和細胞核中表達，呈淡黃色或棕黃色或棕褐色(見圖1c)。HES1在胃癌、癌旁組織和對照組中的表達陽性率分別為36.64%(48/131)、34.40%(11/32)和33.3%(10/30)，三者間差異無統計學意義(χ2=0.148，P=0.929)。

注：1aNotch1；1bDLL4；1cHES1；1d陰性對照

圖 1Notch1、DLL4和HES1在胃癌組織中的表達

(免疫組化染色，×400)

2.2　Notch1、DLL4和HES1共表達結果分析

Notch1和DLL4共同陽性率為15.09%，兩者無相關性(r=-0.036，P=0.584)。Notch1和HES1共同陽性率為12.21%，兩者無相關性(r=-0.052，P=0.450)。DLL4和HES1共同陽性率為15.57%，兩者無相關性(r=0.000，P=0.996)。Notch1、DLL4和HES1共同陽性率為4.72%，三者無相關性(r=-0.014，P=0.901)。

2.3　Notch1、DLL4和HES1的表達與臨床病理特征的關系

有淋巴結轉移組中Notch1表達陽性率(41.3%)顯著低于無淋巴結轉移組(61.28%，χ2=5.797，P=0.016)。在其他不同病理特征組比較中，Notch1陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。不同胃癌病理特征之間DLL4表達的差異無統計學意義(P>0.05)。腸型胃癌的DLL4陽性率(50.63%)與彌漫型胃癌(35.95%)比較，有升高的趨勢(P=0.056)。HES1在低分化胃癌組織中陽性率(51.43%)顯著高于高/中分化組(31.25%)(χ2=4.499，P=0.029)。在其他不同臨床病理特征組比較中，HES1陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4　Notch1、DLL4和HES1的表達與生存期分析

應用Kaplan-Meier生存分析，結果顯示隨訪到的111例患者的半數生存期為(34.21±2.78)個月(2～79個月)。Notch1陽性組和陰性組的平均生存期分別為(49.41±6.55)個月和(44.07±6.01)個月，差異無統計學意義(P>0.05)；DLL4陽性組和陰性組的平均生存期分別為(39.78±5.17)個月和(56.86±7.20)個月，差異無統計學意義(P>0.05)；HES1陽性組和陰性組的平均生存期分別為(35.00±7.37)個月和(49.80±5.54)個月，差異無統計學意義(P>0.05)。

3討論

Notch信號通路由跨膜的受體、配體、核內結合蛋白及靶基因4部分組成，在胚胎正常發育、細胞分化、腫瘤的發生發展等生理病理過程中起著重要的作用[6-7]。目前發現的哺育動物Notch受體包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4 四種，為單鏈跨膜蛋白，具有細胞表面受體和核內轉錄調控雙重功能。Notch信號的配體在果蠅中稱Delta和Serrate，哺乳動物中與Delta同源的配體稱為Delta樣分子(DLL)，與Serrate同源的配體稱為Jagged，共包括5種配體分子，即DLL1、DLL3、DLL4、Jagged-1 和Jagged-2。Notch信號配體與受體的DSL結構域結合，經過γ-分泌酶介導的蛋白酶酶切后，Notch受體的活化形式NICD被釋放入細胞質中，并易位入細胞核與轉錄因子結合，發揮對靶基因的調控作用。Notch信號影響的靶基因主要包括含有堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)結構域的HES和HRT家族[8]。

研究證實，Notch信號通路與多種實體腫瘤如肺腺癌、前列腺癌等的發生發展有關[9-11]。4種Notch受體成員中，Notch1是在腫瘤組織中最常被檢測到的[12]。關于Notch在胃癌組織中的表達情況，目前研究報道有差異，大多數研究支持在胃癌組織表面Notch1的表達升高[13]，亦有研究報道降低[14]。本研究發現，Notch1在胃癌組織中的表達陽性率顯著高于癌旁組織和對照組，提示Notch1在胃癌的發生發展中具有重要的作用，但與患者的生存期無相關性，Notch1可作為胃癌診斷和治療的靶點。本研究還顯示，Notch1在有淋巴結轉移組表達陽性率下降，其機制需要進一步探討。研究表明，Notch1受體活化后與胃癌進展的關系與環氧合酶-2(COX-2)相關。Notch1受體活化后的細胞內片段N1IC可促進細胞集落形成能力和人胃腺癌SC-M1細胞移植瘤生長。N1IC和C啟動子結合因子1(CBF1)結合后，與COX-2啟動子連接，通過依賴CBF1的途徑促進COX-2在SC-M1細胞株中的表達。COX-2通過前列腺素E2與相鄰細胞的細胞膜EP受體結合，經G2蛋白偶聯途徑或過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)促進胃癌生長[15]。另外，Notch1可通過直接作用于核因子-κB(NF-κB)下游的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和/或caspase-3下游的靶基因而發揮抑制凋亡作用[16]。

DLL是Notch信號的重要配體，主要包括DLL1、DLL3和DLL4，均為跨膜糖蛋白，N端富含有半胱氨酸的DSL基序，可以與Notch結合而活化Notch信號[17]。血管的形成在腫瘤的生長和轉移過程中起主要的作用。DLL4在人類多種腫瘤血管組織中過表達，且DLL4的高表達受血管內皮生長因子(VEGF)的正向調節[18]。本研究發現，DLL4在胃癌、癌旁組織和對照組細胞表面的表達，以及DLL4陽性/陰性表達的患者的病理特征、生存期之間差異均無統計學意義。關于DLL4表達與胃癌的關系仍需進一步探討。

HES是Notch信號系統的下游靶基因，屬于bHLH基因家族[8]，表達廣泛。HES1參與細胞的分化，可使多種不成熟細胞維持在未分化狀態，可能在多種腫瘤的發生中起到癌基因的作用[19]。Notch信號活化后，酶切產生的NICD 進入核內，激活下游靶基因HES1，HES1通過負性調節抑癌的磷酸酶和張力蛋白(PTEN)基因，活化磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路，從而促進腫瘤增殖、浸潤和侵襲[20]。本研究結果顯示，HES1在胃癌、癌旁組織和對照組細胞表面的表達，以及HES1陽性/陰性表達的患者生存期之間差異均未見顯著性差異。但是HES1表達與胃癌的分化程度密切相關，在低分化胃癌組織中表達上調，提示HES1可作為反映胃癌分化程度的重要標志物。

Notch1、DLL4和HES1的表達與胃癌患者的生存期之間無相關性，提示Notch信號系統不是胃癌獨立的預后因素。

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(本文編輯：林磊)