大黃素上調PPARγ促進HeLa細胞PTEN表達的實驗研究 *

大黃素上調PPARγ促進HeLa細胞PTEN表達的實驗研究*

鄧潔1張小霞1鄧曉楊1彭聰1羅劍波1朱濤2

(1.成都醫學院第一附屬醫院婦科， 四川 成都 610500；2.四川大學華西醫院呼吸病學研究室/呼吸內科， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探討大黃素對于宮頸癌HeLa細胞增殖的調控作用及其相關機制。方法使用大黃素和/或GW9662 (PPARγ拮抗劑)對HeLa細胞進行干預。在不同時間點(0 h、24h、48h和72h)使用MTT法對HeLa細胞活性進行測定。在干預48h后，使用qPCR和western blot對HeLa細胞PTEN和PPARγ mRNA和蛋白表達水平進行測定。結果GW9662組、大黃素+GW9662組與對照組相比較各時間點細胞活性未見顯著統計學差異(P均>0.05)；但大黃素組與對照組相比較細胞活性呈時間依賴性降低，差異有顯著統計學意義(P均<0.05)。干預48h后，大黃素組PTEN、PPARγ mRNA和蛋白表達較對照組明顯增加，差異有顯著統計學意義(P均<0.05)；但GW9662組和大黃素+GW9662組PTEN、PPARγ mRNA和蛋白表達水平與對照組比較未見顯著統計學差異(P均>0.05)。 結論實驗表明大黃素可以有效抑制HeLa細胞的增殖，并可能與上調PPARγ表達后促進宮頸癌HeLa細胞PTEN的合成密切相關。

【關鍵詞】HeLa細胞； 大黃素； PTEN； PPARγ

【中圖分類號】R 737.33

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.004

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of emodin on the expression of PTEN and cell proliferation in HeLa cells, and its potential mechanism. MethodsMTT was used to measure the cell viabilities at each time points (0h, 24h, 48h and 72h). And qPCR and western blot were performed to measure the mRNA and protein expression of PTEN and PPARγ, respectively. ResultsThe cell viabilities of HeLa cells were time-dependently inhibited by emodin. Meanwhile, after 48 hours intervention, the mRNA and protein expression of PTEN and PPARγ were significantly enhanced by emodin. Nevertheless, emodin induced the inhibition of cell viability, and the increment of PTEN and PPARγ were both markedly abrogated by GW9662 (PPARγ antagonist). ConclusionsEmodin could promote the expression of PTEN through the up-regulation of PPARγ in HeLa cells.

基金項目：中國博士后科學基金(2014M552369)；四川省醫學會科研課題(171140342)

通訊作者：鄧曉楊,E-mail：dengxiaoyang2014@sina.com

收稿日期：( 2015-03-19； 編輯： 陳舟貴)

Emodin promotes PTEN expression via up-regulation of PPARγ in HeLa cellsDENG Jie1, ZHANG Xiaoxia1, DENG Xiao-yang1,etal

(1.DepartmentofGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610500,China;

2.DivisionofPulmonaryDiseases,StateKeyLaboratoryofBiotherapyofChina,DepartmentofRespiratory

Medicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Key words】HeLa cells; Emodin; PTEN; PPARγ

大黃素是中藥大黃最主要的藥理成分，屬于蒽醌類化合物[1～4]。研究發現大黃素具有抑制炎癥反應、抗過敏、抑制真菌和細菌生長、調節氧化應激和抑制纖維化等多種生物活性[1～4]。同時亦有研究發現大黃素對包括乳腺癌、惡性膠質瘤和肺癌等多種腫瘤具有抑制作用[1～4]。進一步研究發現大黃素抗腫瘤等藥理作用的分子機制與促進氧化物酶體增殖激活受體γ (peroxisome proliferators-activated receptor gamma, PPARγ)的表達密切相關[5～8]。本實驗的目的是探討大黃素對于宮頸癌HeLa細胞增殖調控作用及其相關機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料宮頸癌HeLa細胞株(由中國科學院上海細胞庫提供)；大黃素(純度>98%)購于西安崇信天然添加劑有限公司；總RNA抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自日本Takara公司；iQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System購買于美國百樂公司；鼠抗人PPARγ抗體、鼠抗人PTEN抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司。GW9662(美國Cayman Chemicals公司)，DMEM培養基(美國Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純，美國Tedia公司)，DMSO (二甲基亞砜，國藥集團化學試劑有限公司)，MTT試劑盒(美國Promega公司)。其余試劑均為分析純。

1.2檢測方法

1.2.1細胞培養HeLa細胞常規接種在含10%胎牛血清，100g/L青霉素、100g/L鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置于37℃，5% CO2孵箱內培養。每48h換液、傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2細胞活性分析(MTT比色試驗)取對數生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔接種100μL約含5×103個細胞。貼壁后無血清培養細胞16～24h，使細胞同步化。空白對照組加入PBS，陽性試驗組加入對應濃度大黃素和/或GW9662，在37°C，5% CO2條件下培養細胞。使用MTT比色試驗對不同時間點(0 h、24 h、48 h和72 h)的細胞生長狀態進行測定，重復實驗4次。細胞活性(%)=對應時間點(OD干預組/OD對照組)×100 (%)[9]。

1.2.3實時熒光定量PCR (quantitative PCR)檢測PTEN和PPARγ mRNA的表達在干預48小時后，按照試劑盒說明書提取細胞的總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應。PPARγ正義 5′-TGCAG GTGATCAA GAAGA CG-3′，反義5′-AGTG CAACTGGAA GAAGG GA-3′；PTEN正義 5′-TGGAT TCGAC TTAGACT TGACCT-3′，反義 5′-TGG CGGTGTCAT AATGTC TTTC-3′；β-actin正義：5′-TGGCA TTGCCG ACAG GAT-3′，反義：5′-GCTCAG GAGGAGCAAT GATCT-3′。使用β-actin作為內參基因，使用2-△△CT公式計算目的基因相對表達量。ΔΔCt = (Ct,目標-Ct,β-actin)干預組-(Ct,目標- Ct,β-actin)對照組。

1.2.4Western blot法檢測細胞中PTEN和PPARγ蛋白表達按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入鼠抗人PPARγ抗體 (1∶ 800)、鼠抗人PTEN抗體(1∶1000)和鼠抗人β-actin抗體(1∶2000)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.3統計學分析采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，計量資料以均數±標準差表示。兩樣本均數多重比較采用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1MTT法結果分析使用MTT法對不同時間點(0h、24h、48h和72h)的細胞活性進行測定。GW9662 (10μM)組、大黃素+GW9662 (10μM)組與對照組相比較各時間點細胞活性未見顯著統計學差異(P>0.05)。與對照組相比較，大黃素(50mM)組細胞活性呈時間依賴性下降，差異有顯著統計學意義(P均<0.05)，見表1。

表1　MTT比色法測定不同組HeLa細胞在不同時間點的細胞活性 ± s)

注：對應時間點與對照組相比較①P<0.05

2.2PTEN mRNA和蛋白表達在干預48h后，使用qPCR和western blot對HeLa細胞PTEN mRNA和蛋白表達進行分析。發現大黃素(50mM)組PTEN mRNA和蛋白表達明顯增加(P均<0.05)；但GW9662 (10μM)組和大黃素+GW9662 (10μM)組PTEN mRNA和蛋白表達水平與對照組比較未見顯著統計學差異(P均>0.05),見表2和圖1。

圖1HeLa細胞PTEN蛋白表達的western blot結果

Figure 1The western blot results of PTEN expression in HeLa cells

表2　HeLa細胞PTEN和PPARγ mRNA和蛋白表達水平

注：與對照組相比較①P<0.05。

2.3PPARγ mRNA和蛋白表達在干預48h后，使用qPCR和western blot對HeLa細胞PPARγ mRNA和蛋白表達進行分析。發現大黃素(50mM)組PPARγ mRNA和蛋白表達明顯增加(P均<0.05)；但GW9662 (10μM)組和大黃素(50mM)+GW9662 (10μM)組PPARγ mRNA和蛋白表達水平與對照組比較未見顯著統計學差異(P均>0.05)，見表2和圖2。

圖2HeLa細胞PPARγ蛋白表達的western blot結果

Figure 2The western blot results of PPARγ expression in HeLa cells

3討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，目前發病率位居女性惡性腫瘤的第四位，平均每年新發病例528000例[10～13]。同時流行病學調查發現僅2012年全球有超過266000名患者因宮頸癌導致死亡，且數據顯示宮頸癌發病有年輕化的趨勢[10～13]。

大黃素是中藥大黃最主要的有效成分，化學名為1, 3, 8-三羥基石甲基蒽醌屬于蒽醌類化合物[1～4]。目前研究發現大黃素具有抑制炎癥反應、抗過敏、抑制器官纖維化、調節氧化應激和調節細胞凋亡等多種生物學活性[1～4]。同時研究還證實大黃素對多種腫瘤細胞有顯著的抑制作用[5～8]。Huang PH等的研究發現大黃素可以有效抑制乳腺癌MCF-7細胞和 MDA-MB-453細胞的增殖[14]。Ismail S等的研究發現大黃素對惡性膠質瘤U87細胞有抑制作用[15]。He L等研究還證實非小細胞肺癌A549細胞增殖也可被大黃素顯著抑制[16]。我們的研究發現使用大黃素對宮頸癌HeLa細胞干預后，HeLa細胞活性呈時間依賴性降低(表1)。該結果表明大黃素對HeLa細胞有直接的抑制作用。

過氧化物酶體增殖激活受體γ屬于4個PPAR 亞型之一，主要通過蛋白-蛋白相互作用和競爭輔助因子調控核轉錄因子-κB (NF-κB)、轉錄激活因子(STAT)和活化蛋白-1(AP-1)等與腫瘤發生發展相關的核轉錄因子(TF)的活性，進而對多種腫瘤細胞的侵襲、轉移、增殖和凋亡等過程產生廣泛的調節作用[17, 18]。進一步研究發現，PPARγ在多種惡性腫瘤細胞中表達明顯下降，同時研究證明上調PPARγ的表達可以有效抑制肺腺癌A549細胞等多種腫瘤細胞的增殖[18, 19]。近來發現大黃素抗炎和抗纖維化等作用與PPARγ密切相關[5～8]。我們的數據也證實在給予大黃素干預48小時后，HeLa細胞PPARγ的表達水平顯著增加，但大黃素和PPARγ抑制劑GW9662同時干預的HeLa細胞PPARγ表達水平與對照組間未見明顯差異(圖2)。同時在對HeLa細胞活性進行檢測后發現，各時間點(0h、24h、48h和72h)大黃素+GW9662組細胞活性與對照組間無顯著統計學差異(圖1)。以上結果表明大黃素主要是通過上調PPARγ抑制HeLa細胞的增殖。

PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)作為重要的抑癌基因，其轉錄翻譯蛋白產物PTEN在多種腫瘤中具有廣泛的生物學作用[19～21]。PTEN表達下降或突變等的異常情況在人類的不同腫瘤中普遍存在[19～21]。研究證實PTEN的表達缺失和突變與腫瘤的分化異常、增殖能力增強、凋亡障礙以及轉移等密切相關；另一方面，有研究也發現通過基因敲入等方法上調PTEN后，多種腫瘤的增殖和分化水平明顯下降[19～21]。故目前認為PTEN在腫瘤的發生與發展過程中扮演著重要的調節作用。進一步的研究表明PPARγ是調節PTEN基因表達的重要因素[19～21]。Lee SY等人的研究發現PPARγ激動劑可以通過上調PTEN的表達增強吉非替尼對于肺癌A549細胞的抑制作用[19]。Lee KS等人的研究證實在過敏性炎癥反應中PPARγ是PTEN的關鍵調節因子[20]。Paintlia AS等認為PPARγ/PTEN是調控少突膠質細胞分化重要信號通路[21]。本實驗中我們對PTEN的表達進行分析后發現，大黃素干預48小時后HeLa細胞PTEN的表達水平較對照組顯著增加，同時該過程可被PPARγ抑制劑GW9662完全的抑制。該結果表明在HeLa細胞中大黃素可以是通過上調PPARγ促進PTEN的表達。

4結論

本實驗結果表明，大黃素可以通過促進PPARγ的表達上調HeLa細胞PTEN的合成，并抑制HeLa細胞的增殖。該實驗揭示了大黃素對于宮頸癌潛在的抗腫瘤作用和部分的分子機制，但相關的信號通路以及PTEN對于宮頸癌腫瘤生物學的調節作用還需更加深入的實驗探討。

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