巴戟天含藥血清對成骨-破骨細胞共育體系原癌基因、核心結合因子1 mRNA表達的影響

巴戟天含藥血清對成骨-破骨細胞共育體系原癌基因、核心結合因子1 mRNA表達的影響

李藝敏陳健1何劍全1張永晟2

(福建中醫(yī)藥大學， 福建福州350108)

摘要〔〕目的觀察不同濃度巴戟天含藥血清對體外培養(yǎng)成骨-破骨細胞共育體系中原癌基因(C-FOS)、核心結合因子(Cbfa)1 mRNA表達的影響。方法提取24 h內新生SD乳鼠顱蓋骨分離培養(yǎng)成骨細胞，采用5周齡SD大鼠雙側股骨、脛骨的骨髓基質細胞，加入集落細胞刺激因子(M-CSF)和細胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)誘導培養(yǎng)破骨細胞。采用堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定成骨細胞，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、骨吸收陷窩甲苯胺藍染色、電鏡掃描等鑒定破骨細胞，體外建立成骨-破骨細胞共育體系，設置低、中、高三種濃度巴戟天含藥血清組和不含藥血清組，干預3 d后提取各組總RNA，應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法測定各組C-FOS、Cbfa1 mRNA表達量。結果不同濃度巴戟天含藥大鼠血清對成骨-破骨細胞共育體系C-FOS有抑制作用，對Cbfa1 mRNA的表達有促進作用。高濃度含藥血清組兩者的表達差異顯著(P<0.05，P<0.000 1)。結論巴戟天含藥血清可抑制成骨-破骨細胞共育體系C-FOS的表達，促進Cbfa1 mRNA的表達，從而達到降低破骨細胞分化成熟及骨吸收活性，促進骨形成。

關鍵詞〔〕巴戟天；成骨-破骨細胞共育體系；原癌基因(C-FOS)；核心結合因子(Cbfa)1

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81272168)；福建省醫(yī)學創(chuàng)新課題資助項目(No.2012-CXB-32)

通訊作者：陳健(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事骨質疏松研究。

1廈門大學附屬中山醫(yī)院康復醫(yī)學科2廈門大學醫(yī)學院

第一作者：李藝敏(1986-)，女，在讀碩士，主要從事骨質疏松研究。

Effects of Morinda officinalis-containing serum on the mRNA expression of C-FOS and Cbfa1 in osteoblast and osteoclast co-cultured system

LI Yi-Min,CHEN Jian,HE Jian-Quan,etal.

Traditional Chinese Medicine University of Fujian,Fuzhou 350108,Fujian,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of the serum of Morinda officinalis(RMO) on the mRNA expression of C-FOS and core binding factor Alpha1(Cbfa1) in osteoblast and osteoclast co-cultured system. MethodsOsteoblasts were separated from the cranium of 24 hours newborn SD rat. Bone marrow cells were harvested from bilateral femora and tibiae of five weeks old SD rat,and M-CSF and RANKL were used to induce osteoclast formation. Osteoblast cells were confirmed by alkaline phosphatase(ALP) stain,osteoclast cells were confirmed by tartrate resistant acidphos phatase(TRAP) stain,Toluidine blue stain and bone resorption assay. Osteoblast and osteoclast co-cultured system was established in vitro. Low,middle,high concentrations of serum RMO and control groups were set. Total RNA was extracted after intervention 3 days,C-FOS and Cbfa1 mRNA expression were measured by real-time PCR. ResultsDifferent concentrations serum of RMO had inhibitory effect on the expression of C-FOS and enhance the mRNA expression of Cbfa1 mRNA,and the function on both indicated a statistically significant difference at high concentration(P<0.05,P<0.000 1). ConclusionsThe serum of RMO could down-regulate the expression of C-FOS and up-regulate Cbfa1 mRNA in osteoblast and osteoclast co-cultured system,consequently reduce osteoclast differentiation and activity of bone resorption,enhance bone formation.

【Key words】Morinda officinalis;Osteoblast and osteoclast co-cultured system;C-FOS;Core binding factor Alpha1

巴戟天能夠有效減少骨量丟失，是中醫(yī)治療骨質疏松常用的中藥之一，能有效提高去卵巢后大鼠骨密度(BMD)而起到抑制骨吸收作用。但巴戟天的有效成分及作用機制仍不明確。當前巴戟天對成骨(OB)-破骨細胞(OC)共育體系影響的研究甚少，尤其是對OC分化、成熟信號通路上原癌基因(C-FOS)以及OB分化信號通路核心結合因子(Cbfa)1基因的影響未見報道。本文觀察巴戟天含藥血清對OB-OC細胞共育體系的影響，探討其抗骨質疏松的分子作用機制。

1材料與方法

1.1實驗材料新生SD乳鼠及5周齡SD 大鼠(廈門大學實驗動物中心提供〔SYXK(閩)2007-0004〕)。胎牛血清DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、Ⅱ型膠原酶(Gibco)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、 細胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)(Peprotech)，抗酒石酚酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(Sigma)，巴戟天顆粒(培力藥業(yè)有限公司)。

1.2含藥血清制備選用9只正常SD大鼠，每組3只，禁食12 h后，巴戟天溶液灌胃給藥，給藥劑量相當于臨床等效劑量(根據人和動物體表面積折算的等效劑量比率表計算)，所定低、中、高劑量分別為0.5，1，3 g/kg(1 g相當于生藥3 g)。給藥2次/d，灌胃3 d，最后一次服用全天劑量。采血前禁食12 h，末次給藥1 h后將大鼠麻醉，無菌條件下心臟采血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清，同組血清混合，56℃水浴，30 min滅活，分裝，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3不含藥血清的制備選用3只正常SD大鼠，只用生理鹽水灌胃，方法同前。

1.4細胞培養(yǎng)

1.4.1OB培養(yǎng)取新生的SD大鼠乳鼠4只，置于75 %乙醇溶液中浸泡10 min。無菌條件下，取頭骨，去除周圍軟組織及骨膜，剪碎成0.5 mm×0.5 mm大小的骨塊，將骨碎片置于含2.5%乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶液中消化30 min,離心棄液加Ⅱ型膠原酶繼續(xù)消化1 h，每隔10 min振蕩一次，1 h后離心800 r/min，3 min，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸后再次離心(800 r/min，3 min)，骨碎片接種于培養(yǎng)皿內，加入4 ml的DMEM全培養(yǎng)液，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，隔3 d換一次液，等細胞鋪滿皿底后，采用差速貼壁法將成骨細胞純化，重復3次后，再置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，隔3 d換液一次。

1.4.2OC培養(yǎng)按照文獻〔1〕的方法分離大鼠骨髓基質細胞，加入M-CSF和RANKL誘導培養(yǎng)OC。

1.5體外建立OB、OC共育體系及含藥血清干預培養(yǎng)5 d后分別用胰酶消化OC和第二代OB，將2×104個/ml的OC和2×104個/ml的OB加入6孔培養(yǎng)板中，充分混勻，制備成細胞懸液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內共育培養(yǎng)2 d。2 d后更換培養(yǎng)液，改用不同濃度巴戟天含藥大鼠血清的培養(yǎng)基與不含藥大鼠血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。

1.6細胞形態(tài)特征觀察用顯微鏡觀察培養(yǎng)后的OB、OC細胞生長形態(tài)。

1.7OB、OC染色鑒定將貼有第二代成骨細胞的玻片取出，按說明書進行堿性磷酸酶(ALP)染色；7 d后將貼有破骨樣細胞的玻片取出，按說明書進行TRAP染色，中性樹膠封固后光鏡下觀察，TRAP(+)且細胞核≥3為破骨細胞。

參考文獻1.8OC骨吸收功能的檢測甲苯胺藍染色、電鏡掃描〔1〕進行。

1.9C-FOS、Cbfa1 mRNA表達的檢測用Trizol(Sigma公司，美國)提取各組總RNA，采用紫外分光光度計計算OD260/OD280比值，確定RNA純度。逆轉錄合成cDNA。PCR引物序列見表1。內參基因β-actin作為參照標準序列的設計公司(上海吉瑪生物工程公司)。聚合酶鏈(PCR)反應混合物：FastStart Universal SYBR Green Master mix(羅氏公司，德國)，加蒸餾水至最終體積為50 μl。在實時PCR擴增儀(ABI7500，美國)進行PCR反應，并使用系統(tǒng)(SDS文件)進行分析。按上述條件進行擴增循環(huán)。采用2-△△CT方法分析相關基因表達的數據。靶基因= 2-ΔΔCT×控制，ΔΔCT =治療組(CT目的基因-CT參照基因)-對照組(CT目的基因-CT參照基因)。

表1PCR引物序列

基因引物序列條件產物長度(bp)C-FOS5'-CCCGTAGACCTAGGGAGGAC-3'5'-GAATACACTCCATGCGGTTG-3'(40)95℃,30s;60℃,45s;72℃,60s234Cbfa15'-AGTCCCAACTTCCTGTGCT-3'5'-GGTGAAACTCTTGCCTCGTC-3'(40)95℃,30s;60℃,45s;72℃,60s243β-actin5'-GAACCCTAAGGCCAACCGTG-3'5'-AGGCATACAGGGACAACACAGC-3'(35)94℃,45s;55℃,60s;72℃,60s315

1.10統(tǒng)計學分析使用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1OB形態(tài)觀察及鑒定顱蓋骨碎片培養(yǎng)24 h后,可見少量細胞貼壁生長，呈長梭形，胞質透亮、飽滿，48 h觀察細胞數量逐漸增多，相鄰骨塊長出的細胞開始融合，72 h后細胞鋪滿瓶底，貼壁生長良好。第2代培養(yǎng)24 h后細胞貼附增殖加快，細胞膨大，呈不規(guī)則形或三角形；48 h后可見大部分細胞貼壁，伸展，成長梭形，3 d后細胞形態(tài)多樣化，呈梭形、不規(guī)則形、多角形，5 d后細胞生長緊密連接，融合成片，部分區(qū)域重疊生長。細胞傳代培養(yǎng)2 d后經ALP染色，95%以上的OB胞質呈陽性反應，胞質深藍色，胞質和突起富含黑色顆粒ALP。見圖1。

圖1　OB形態(tài)及鑒定(ALP染色，×400)

2.2OC誘導培養(yǎng)結果及鑒定如圖2所示，接種24 h后細胞開始逐漸貼壁，為體積均一的圓形細胞，分布均勻，72 h后細胞形態(tài)多樣化，出現(xiàn)多核細胞(圓形、漏斗形、橢圓形或臘腸形等)，細胞邊緣不規(guī)則，有突起和片狀或絲狀偽足，細胞內可見

TRAP染色(×100)

骨陷窩甲苯胺藍染色(×200)

骨陷窩電鏡掃描(×2 000)

圖2OC形態(tài)及鑒定

到幾個或十幾個細胞核，胞質有大小不等的空泡，色淡紅，TRAP染色陽性；OC形態(tài)隨著培養(yǎng)時間延長不斷發(fā)生變化，體積不斷增大，細胞數量逐漸增多融合。培養(yǎng)6 d后，甲苯胺藍染色可見陷窩呈圓形、橢圓形、不規(guī)則形、臘腸型等多樣形態(tài)的藍色或紫藍色深色區(qū)域；電鏡掃描可見與正常骨組織相比陷窩明顯凹陷，部分陷窩呈串珠樣連接，陷窩融合后面積增大，邊緣延續(xù)成貝殼狀或不規(guī)則形狀，形成纖維基底樣形態(tài)。

2.3各組C-FOS、Cbfa1 mRNA基因表達的比較不含藥血清組C-Fos、cbfal mRNA表達量為1.03±0.29,1.01±0.13；低劑量合藥血清組分別為0.70±0.49,1.02±0.18；中劑量含藥血清組分別為0.48±0.17，1.26±0.05；高劑量合藥血清組分別為0.02±0.02，5.55±0.58。高濃度含藥血清組C-Fos及Cbfa1 mRNA與無含藥血清組比較差異顯著(P=0.016 2，P<0.000 1)。

3討論

OB和OC是骨重建的效應細胞，骨組織新陳代謝的動態(tài)平衡是通過OB促進骨形成，OC促進骨吸收來維系的。OB和OC之間的功能活動并不是相互獨立的，二者之間的信號交談對彼此功能的影響至關重要〔2〕。近年來中醫(yī)藥干預骨質疏松方面的體外實驗，多是采用含藥血清單純對OB或OC干預實驗，并不能代表體內骨代謝的實際情況。本實驗采用分別培養(yǎng)OB與OC，然后以1∶1比例建立共育體系，更符合骨代謝的微環(huán)境，便于研究OB與OC之間的信號交談及探討相關信號分子的作用機制。

中藥巴戟天具有滋補肝腎,強筋壯骨，祛風除濕等功能。有研究證明,巴戟天能夠提高去卵巢大鼠血清鈣、磷及護骨素水平;抑制OC分化及骨吸收，顯著提高去卵巢大鼠股骨的骨密度〔3~6〕，說明巴戟天能夠改善絕經后的骨量丟失,發(fā)揮抗骨質疏松作用。鮑蕾蕾等〔7〕實驗表明巴戟天甲基蒽醌通過抑制OC的形成、分化和骨吸收功能來減少骨量丟失。何劍全等〔8〕實驗發(fā)現(xiàn)巴戟天可降低骨質疏松大鼠OC RANK和CAⅡ的表達，從而達到抑制骨質疏松的作用。還有研究〔9，10〕發(fā)現(xiàn)巴戟天在一定程度上能夠抑制OB的凋亡，促進體外培養(yǎng)OB增殖。以上研究提示巴戟天抗骨質疏松的作用不單是通過抑制骨吸收，還有促進骨形成。近年來,在骨質疏松防治方面，中醫(yī)藥的研究有很大進展〔11〕。

C-FOS基因是原癌基因的重要成員。其表達產物C-FOS蛋白具有多種生物學作用,參調控細胞的生長、增殖、分化等。C-FOS在OC分化過程中起重要的調控作用〔12〕。有研究〔13〕顯示紫穗槐素能夠通過下調C-FOS、治化T細胞核因子(NFATc)1的表達，阻止OC生成。林華等〔14〕的實驗提示癌基因C-FOS與原發(fā)性骨質疏松的關系密切，原發(fā)性骨質疏松時C-FOS表達增高與骨細胞和OB的凋亡有關。在代謝性疾病的研究中，發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rh2可控制癌癥和其他包括OC分化的代謝疾病,其可抑制骨髓巨噬細胞向OC分化，顯著降低誘導轉錄因子C-FOS和T細胞活化的核因子RANKL的表達〔15〕。研究〔16〕發(fā)現(xiàn)咖啡酸苯乙酯可抑制OC分化形成，且通過抑制RANKL及其下游的NFATc1和C-FOS轉導通路抑制OC的形成。羧酸通過抑制OC前體細胞C-FOS蛋白的表達，從而阻止OC形成，防止骨量丟失〔17〕，說明C-FOS基因與骨質疏松的發(fā)生密切相關。本研究說明巴戟天含藥血清能夠通過抑制C-FOS mRNA的表達降低骨吸收活性，阻止骨量丟失。

Cbfa1是骨形成的關鍵因子,它能上調非OB或OB前體細胞成骨分化相關基因的表達,使其向OB分化〔18〕。Cbfa1在胚胎骨發(fā)育期,間充質細胞凝集階段就有表達,此階段缺失Cbfa1將無OB形成〔19〕。李楠等〔20,21〕發(fā)現(xiàn)巴戟天多糖能夠促進OB轉化生長因子β1 mRNA、Cbfa1 mRNA的表達。有研究〔22〕表明染料木素可通過p38 MAPK-Cbfa1途徑，刺激骨髓基質細胞向OB分化。Cbfa1與骨髓基質細胞向OB分化過程密切相關,而巴戟天水提物和巴戟天醇提物均能使此過程中Cbfa1表達加強,且巴戟天醇提物使Cbfa1的表達強于巴戟天水提物，提示巴戟天的作用機制主要是促進骨髓基質細胞成骨分化,從而達到骨形成。本試驗中隨著巴戟天含藥血清濃度的上升，在高濃度時出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，說明巴戟天含藥血清可以通過加強Cbfa1 mRNA的表達促進骨形成。

本實驗表明了巴戟天含藥血清在這個共育體系中能夠顯著抑制OC C-FOS的表達；巴戟天含藥血清能夠促進共育體系中OB分化，抑制OC成熟，從而達到抑制骨吸收，促進骨形成的功能作用。巴戟天抗骨質疏松的詳細分子作用機制及具體的有效成分尚不明確，有待進一步研究。

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〔2014-10-09修回〕

(編輯馮超/曹夢園)