基于生物信息學技術分析老年人頸動脈不穩定斑塊差異基因表達譜

基于生物信息學技術分析老年人頸動脈不穩定斑塊差異基因表達譜

奈文青丁宇張克偉1王媛媛單蘭蘭傅友吳洪淵丁燕戴萌

(南方醫科大學南方醫院，廣東廣州510515)

摘要〔〕目的探討老年患者頸動脈不穩定斑塊發生的分子機制。方法從ArrayExpress數據庫下載基因表達譜數據集E-MTAB-2055。該數據包含24例頸動脈不穩定斑塊和24例穩定斑塊，分別來源于24例老年頸動脈粥樣硬化患者。通過系列數據分析從中篩選差異表達基因，并通過富集分析獲取與不穩定斑塊有關的生物學過程和通路。同時，通過構建差異表達基因的生物網絡尋找與該疾病高度相關的風險模塊。結果不穩定斑塊中發生顯著性差異表達變化的基因共有439個，其中上調基因為232個，下調基因為207個。涉及到的生物學過程和通路大部分與炎癥和免疫應答有關。生物網絡和模塊分析提示CXCR4、VCL和TYROBP 可能在老年患者不穩定斑塊發生發展過程中發揮著重要作用。結論本研究比較完整地揭示了老年患者頸動脈不穩定斑塊差異表達譜特征和涉及的生物學過程及信號通路，其中CXCR4、VCL和TYROBP可能參與不穩定斑塊發生發展。

關鍵詞〔〕不穩定斑塊；動脈粥樣硬化；基因表達譜；差異表達基因；生物信息學

中圖分類號〔〕R543.4〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：南方-哈佛“健康醫療云服務”平臺關鍵技術創新、集成與應用(2013J4500040穗科信字〔2013〕184號)

通訊作者：戴萌(1963-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事血管衰老早期干預研究。

1河南省人民醫院

第一作者：奈文青(1988-)，女，在讀碩士，主要從事動脈粥樣硬化早期干預研究。

越來越多的研究表明，急性心腦血管事件的發生不僅取決于動脈管腔的狹窄程度，更重要的決定因素是動脈粥樣硬化(AS)不穩定斑塊的形成〔1〕。不穩定斑塊形成的病理生理學機制主要包括斑塊內炎癥反應的增加、新生血管形成和細胞大量凋亡，而誘導這些病理生理過程改變的分子機制并不完全清楚〔2，3〕。基因表達芯片技術可同時比較成千上萬個基因的表達變化，全面篩選某一表型或某一疾病的所有相關基因，還可揭示不同基因表達變化之間的相互關系，從而為研究基因與基因之間的內在聯系提供線索。本研究通過基因芯片技術分析獲取老年患者不穩定斑塊和穩定斑塊間差異表達基因(DEGs)，并運用生物信息學方法分別在基因本體(GO)、通路和蛋白互作網絡中分析不穩定斑塊形成的分子機制，旨在尋找該疾病相關生物學過程、通路和風險模塊。

1材料與方法

1.1數據來源及樣本描述本研究使用的E-MTAB-2055數據集來源于ArrayExpress數據庫(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)，采用的芯片是A-MEXP-931-Illumina HumanRef-8 v2 Expression BeadChip。

該芯片數據的樣本包含24例晚期穩定斑塊組織和24例不穩定斑塊組織，均來源于經頸動脈內膜剝脫術后患者病變血管，獲取的斑塊組織經病理學鑒定分為穩定斑塊和不穩定斑塊兩部分，病人年齡61~83歲，平均68.69歲，上述所取血管組織包含血管內膜和中膜，不包含血管外膜〔4〕。

1.2數據處理方法

1.2.1表達譜數據預處理從ArrayExpress數據庫中下載E-MTAB-2055的CEL文件后，分別在R軟件(R3.0.0)中運行Lumi包〔5〕和Limma包〔6〕，并使用包中的線性模型方法、經驗Bayes算法和歸一化算法分別對探針水平的信號值進行質控、變異穩定性分析、背景矯正、數據歸一化和基因注釋，最終轉化為基因水平的表達值。

1.2.2獲取DEGs使用t檢驗和倍比法(FC)識別DEGs。DEGs篩選閾值為P≤0.01且|logFC|>1。

1.2.3DEGs功能富集分析通過DAVID網站〔7〕(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)提交基因表達譜獲取的DEGs分別進行GO語義〔8〕和KEGG通路〔9〕富集分析。篩選富集分析GO語義和KEGG通路的閾值分別為FDR≤0.01和P≤0.05。

1.2.4蛋白互作網絡構建和尋找疾病相關模塊首先從string〔10〕(版本號9.1)網站下載人類所有的蛋白互作關系列表，通過在R軟件中對蛋白互作列表進行預處理如去冗余、自身互作等并保留互作可信度得分> 0.7的蛋白互作對，然后映射DEGs到蛋白互作網絡，僅保留DEGs間的互作關系，獲取DEGs在蛋白互作層面的生物網絡。最后，將DEGs構建的生物網絡導入到Cytoscape〔11〕(版本號2.8.2)實現生物網絡可視化，并進行網絡度的計算和查找疾病相關模塊。

2結果

2.1篩選DEGs結果滿足篩選閾值要求的DEGs共439個，上調基因232個，下調基因207個，差異表達上調基因倍比變化最大的基因是heme oxygenase 1(HMOX1，logFC=3.1)，差異表達下調基因倍比變化最大的基因是alpha-actin(ACTC1，logFC=-2.2)。

2.2生物學意義的分析結果

2.2.1DEGs功能富集分析結果GO富集分析結果顯示共有15個生物學過程語義滿足富集閾值要求，Term：response to wounding，defense response，immune response，inflammatory response，taxis，chemotaxis，cell adhesion，biological adhesion，locomotory behavior，cytoskeleton organization，muscle system process，actin cytoskeleton organization，actin filament-based process，negative regulation of cell proliferation,muscle contraction，均P<0.001，FDR<0.001。其中，免疫應答、免疫防御、炎癥應答、細胞因子等富集顯著性最高，位于富集結果最前面。

通路富集結果顯示9個通路符合富集閾值要求(表1)。富集通路包括免疫系統相關通路(細胞因子信號通路、白細胞跨膜遷移通路、造血細胞譜系和補體凝血級聯反應)、細胞過程(溶酶體通路、肌動蛋白細胞骨架調節)、環境信息處理(細胞因子-細胞因子受體互作)、內分泌系統通路(PPAR信號通路)和代謝(色氨酸代謝)。結果顯示富集到的免疫相關通路數目最多，而富集顯著性最高的通路是溶酶體通路。

表1差異表達基因富集KEGG通路結果

PathwayP值PathwayClassLysosome<0.001CellularProcesses;TransportandcatabolismChemokinesignalingpathway<0.001OrganismalSystems;ImmunesystemPPARsignalingpath-way<0.001OrganismalSystems;EndocrinesystemCytokine-cytokinere-ceptorinteraction0.002EnvironmentalInformationPro-cessing;SignalingmoleculesandinteractionLeukocytetransendo-thelialmigration0.004OrganismalSystems;ImmunesystemHematopoieticcellline-age0.006OrganismalSystems;ImmunesystemRegulationofactincy-toskeleton0.021CellularProcesses;CellmotilityComplementandcoag-ulationcascades0.023OrganismalSystems;ImmunesystemTryptophanmetabo-lism0.039Metabolism;Aminoacidmetab-olism

網絡中圓形結點表示差異表達基因，邊表示差異基因間互作，紅色結點表示上調的DEG，藍色結點表示下調的DEG 圖1　差異表達基因構建蛋白互作網絡

2.2.2DEGs映射蛋白互作網絡和尋找疾病模塊分析結果本研究利用STRING數據庫提供的人類蛋白互作信息構建DEGs在蛋白層面互作關系，并在cytoscape中實現可視化(圖1)。為了進一步深入揭示不穩定斑塊發生發展機制，對該蛋白互作網絡進行聚類分析并查找疾病相關風險模塊。在不穩定斑塊形成過程中，這些模塊中差異基因可能發揮協同調控作用共同促進不穩定斑塊發生。按模塊中基因總數不少于5的閾值標準，本研究共獲取了四個與不穩定斑塊相關的風險模塊(圖2)，所有模塊中互作基因差異表達方向均一致，同時，TYROBP、CXCR4、VCL和APOE分別是四個模塊中的樞紐基因。

紅色結點代表差異上調基因，藍色結點代表差異下調基因 圖2　蛋白互作網絡中獲取的4個模塊

3討論

本研究共獲取了439個DEG，其中上調基因232個，下調基因207個，它們共同構成了老年患者不穩定斑塊差異基因表達譜，與不穩定斑塊的形成密切相關，從分子生物學角度再次證實穩定斑塊發展為不穩定斑塊是一個復雜的病理生理過程。GO和通路富集分析結果顯示，炎癥和免疫應答等相關生物學過程和通路被顯著富集。

蛋白互作網絡和模塊分析結果顯示 CXCR4、VCL和TYROBP在模塊和蛋白互作網絡中均處于中心位置，可能在促進斑塊發生不穩定轉化的病理過程中發揮著重要作用。CXCR4位于染色體2q21，屬于G蛋白耦聯趨化因子受體，可以與基質細胞衍生因子(SDF)-1發生特異性結合，參與趨化、細胞阻滯、血管生成和細胞生存等過程，促進HIV病毒轉染宿主細胞、自身免疫性疾病發生和腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲〔12〕。Melchionna等〔13〕通過不同強度剪切應力處理人臍靜脈內皮細胞發現低血流剪切力可以引起血管內皮損傷，損傷的血管內皮細胞較正常血管內皮細胞高表達CXCR4蛋白，從而誘導內皮細胞凋亡，研究者推測CXCR4可能參與早期動脈粥樣硬化斑塊形成，而下調CXCR4對血管起保護作用。國內研究人員通過使用冠心康干預小鼠主動脈粥樣硬化進程發現，伴隨主動脈粥樣硬化程度減輕，冠心康組小鼠主動脈組織中SDF-1和CXCR4表達水平明顯低于未干預組，研究者推測SDF-1/CXCR4軸可能是藥物干預動脈粥樣硬化進程的作用靶點〔14〕。de Gaetano等〔15〕研究表明，ApoE(-/-)小鼠上使用共軛亞油酸抑制CXCR4表達可以誘導早期動脈粥樣斑塊消退，降低斑塊局部白細胞粘附能力和數量。與上述研究不同，Yao等〔16〕研究顯示，在不穩定動脈粥樣斑塊模型鼠上，外源性靜脈輸注SDF-1通過激活SDF-1/CXCR4軸，募集保護性骨髓源性血管祖細胞，可誘導晚期不穩定斑塊轉歸為穩定斑塊。上述研究反映了CXCR4在動脈硬化發生發展過程中角色的復雜性和功能多樣性，可能與不同研究中使用的動物模型(如小鼠遺傳背景和造模方法差異)、斑塊不同分期和血管祖細胞亞型差異有關。此外，通路富集分析結果顯示該基因主要參與細胞因子信號通路、細胞因子-細胞因子受體互作和白細胞跨膜遷移。CXCR4在本研究中差異上調，結合國內外相關研究認為該基因異常表達可能與不穩定斑塊形成有關，需要進一步驗證。VCL又稱為黏著斑蛋白，位于染色體10q22.2，是一種細胞骨架蛋白，參與細胞-細胞或細胞-基質之間連接。Constantinescu等〔17〕研究發現，高血脂血清刺激鼠主動脈內皮細胞會引起VCL表達和分布發生異常改變，研究者推斷VCL的異常變化可能促進動脈粥樣硬化發生發展。另一項研究通過蛋白組學技術分析冠狀動脈粥樣硬化斑塊和早期病變血管中膜組織中差異蛋白，發現VCL蛋白在斑塊組織中表達下調，而后續免疫組化實驗也證實了VCL表達水平的降低。研究者推斷，在動脈粥樣硬化進程中，VCL的表達異常促進動脈粥樣硬化進展〔18〕。Rocchiccioli等〔19〕運用高效液相色譜法和質譜技術分析14對頸動脈斑塊組織和斑塊旁組織發現，與斑塊旁組織相比，斑塊組織低表達VCL蛋白，隨后免疫組化和蛋白印跡證實VCL在斑塊組織中表達下調，并推測VCL下調可能參與動脈硬化斑塊發生發展。VCL富集到的通路主要是白細胞跨膜遷移和肌動蛋白細胞骨架調節。VCL在本研究中差異下調，其可能參與不穩定斑塊形成，有待進一步實驗驗證。TYROBP，別名DAP12，位于染色體19q13.1，編碼一種跨膜信號分子多肽，其編碼的蛋白主要參與骨塑形、大腦髓鞘形成、信號傳導和炎癥反應〔20〕。值得一提的是，TYROBP基因在本研究中差異上調，但是其在動脈硬化斑塊的表達情況尚未見報道，可能是不穩定斑塊發生過程中新的診斷或預后相關基因，其差異驗證和功能分析將是我們下一步研究的重點。

4參考文獻

1張會娟，陳雪俠，楊艷秋，等.老年高血壓患者外周血管動脈粥樣硬化相關危險因素分析〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(2):304-5.

2Hennerici MG.The unstable plaque〔J〕.Cerebrovasc Dis，2004;17 Suppl 3:17-22.

3李蓉，蔡輝.內皮細胞凋亡與動脈粥樣硬化關系的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2012;32(12):2649-52.

4Eijgelaar WJ，Manca M，Herías MV，etal.Multi-platform approach for plaque-derived biomarkers for the vulnerable plaque〔J〕.Challenges Promises，2014;9(13):43-9.

5Du P，Kibbe WA，Lin SM.Lumi: a pipeline for processing Illumina microarray〔J〕.Bioinformatics，2008;24(13):1547-8.

6Smyth GK，Michaud J，Scott HS.Use of within-array replicate spots for assessing differential expression in microarray experiments〔J〕.Bioinformatics，2005;21(9):2067-75.

7Dennis GJ，Sherman BT，Hosack DA，etal.DAVID: database for annotation，visualization，and integrated discovery〔J〕.Genome Biol，2003;4(5):P3.

8Blake JA，Dolan M，Drabkin H，etal.The gene ontology: enhancements for 2011〔J〕.Nucleic Acids Res，2012;40(Database issue):D559-64.

9Kotera M，Hirakawa M，Tokimatsu T，etal.The KEGG databases and tools facilitating omics analysis: latest developments involving human diseases and pharmaceuticals〔J〕.Methods Mol Biol，2012;802:19-39.

10Franceschini A，Szklarczyk D，Frankild S，etal.STRING v9.1: protein-protein interaction networks，with increased coverage and integration〔J〕.Nucleic Acids Res，2013;41(Database issue):D808-15.

11Shannon P，Markiel A，Ozier O，etal.Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks〔J〕.Genome Res，2003;13(11):2498-504.

12Doring Y，Pawig L，Weber C，etal.The CXCL12/CXCR4 chemokine ligand/receptor axis in cardiovascular disease〔J〕.Front Physiol，2014;5:212.

13Melchionna R，Porcelli D，Mangoni A，etal.Laminar shear stress inhibits CXCR4 expression on endothelial cells: functional consequences for atherogenesis〔J〕.FASEB J，2005;19(6):629-31.

14秦合偉，劉萍.冠心康抗動脈粥樣硬化作用機制與SDF-1/CXCR4生物軸失衡相關性的研究〔J〕.中華中醫藥雜志，2014;29(5):1558-62.

15de Gaetano M，Dempsey E，Marcone S，etal.Conjugated linoleic acid targets beta2 integrin expression to suppress monocyte adhesion〔J〕.J Immunol，2013;191(8):4326-36.

16Yao L，Heuser-Baker J，Herlea-Pana O，etal.Bone marrow endothelial progenitors augment atherosclerotic plaque regression in a mouse model of plasma lipid lowering〔J〕.Stem Cells，2012;30(12):2720-31.

17Constantinescu E，Alexandru D，Raicu M，etal.Exposure to hypercholesterolemic serum modifies the expression of cytoskeletal proteins in cultured endothelia〔J〕.J Submicrosc Cytol Pathol，1997;29(4):543-51.

18de la Cuesta F，Zubiri I，Maroto AS，etal.Deregulation of smooth muscle cell cytoskeleton within the human atherosclerotic coronary media layer〔J〕.J Proteomics，2013;82(2):155-65.

19Rocchiccioli S，Pelosi G，Rosini S，etal.Secreted proteins from carotid endarterectomy: an untargeted approach to disclose molecular clues of plaque progression〔J〕.J Transl Med，2013;11(3):260.

20Takaki R，Watson SR，Lanier LL.DAP12: an adapter protein with dual functionality〔J〕.Immunol Rev，2006;214(2):118-29.

〔2015-03-18修回〕

(編輯徐杰)