維甲酸對皮膚角阮細胞水孔蛋白通道3表達的影響

維甲酸對皮膚角阮細胞水孔蛋白通道3表達的影響

陳建華

(江西中醫藥高等專科學校人體解剖學教研室，江西撫州344000)

摘要〔〕目的探討維甲酸類藥物對表皮角阮細胞中水孔蛋白通道(AQP)3表達的影響。方法異維A酸、阿維A、阿達帕林處理角朊細胞的體外培養模型(HaCaT)，采用免疫組化、RT-PCR、Western印跡分子生物學方法檢測不同濃度(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)、不同作用時間(0、6、12、24、48 h)及不同干預因素下對HaCaT中AQP3含量的變化。結果①濃度為0.010 mg/ml時，三組HaCaT中AQP3的表達均高于其他濃度(P<0.05)；②0.010 mg/ml濃度的異維A酸、阿維A、阿達帕林作用12 h，三組HaCaT中AQP3的表達異維A酸組>阿維A組>阿達帕林組，組間比較差異顯著(P<0.05)。結論維甲酸可調節HaCaT中AQP3的表達，0.010 mg/ml濃度的異維A酸組12 h的時候對HaCaT中AQP3表達的上調作用最明顯。

關鍵詞〔〕水孔蛋白通道3；維甲酸；角阮細胞；表皮細胞

中圖分類號〔〕R39〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：陳建華(1972-)，男，主治醫師，講師，主要從事解剖組織學研究。

維甲酸類藥物屬維生素A的衍生物，現已廣泛用于多種異常角化、增殖性皮膚病及抗衰老、抗氧化等美容方面的治療，臨床療效確切〔1〕。但其一個非常明顯且不可避免的副作用就是皮膚黏膜干燥、脫屑、皸裂，以補充水分、保濕劑等一般處理不能緩解，眾多患者因不能耐受中斷治療，失去治愈疾病的機會〔2〕。水孔蛋白(AQPs)是一種位于細胞膜上的蛋白質，在細胞膜上組成孔道，可控制水在細胞的進出。在人體內目前發現已有AQPs11種，不僅存在于腦室膜、心臟、肺泡、膽道系統、腎臟、晶狀體內囊、外分泌腺上皮細胞等和水、金屬鹽代謝有關的器官、組織，也存在于表皮的角阮細胞胞膜〔3，4〕。已有文獻證實AQP3對于皮膚屏障功能的恢復起著重要的作用，通過調節AQP3的表達及功能變化，可以從一定程度上改善皮膚水分含量減少以及改善干燥性的皮膚病〔5~7〕。維甲酸引起皮膚黏膜干燥的副作用是否與AQP3的表達有關，目前尚無相關研究。本文研究維甲酸對人源角朊細胞(HaCaT)AQP3表達的影響。

1材料和方法

1.1主要試劑、細胞與儀器HaCaT(中國科學院細胞庫)，含血清的完全培養基及不含血清培養基(美國GIBCO公司)，PCR試劑盒(上海碩盟生物)，免疫組化試劑盒(武漢博士德)，HRP標記山羊抗小鼠IgG，HRP標記山羊抗兔IgG(上海碧云天生物)，含EDTA的胰酶(美國GIBCO公司)，一抗：AQP3兔單克隆IgG和β-actin小鼠多克隆IgG(美國Santa Cruz公司)。異維A酸(商品名為泰爾絲，上海信誼延安藥業有限公司生產)、阿維A(商品名為方希，重慶華邦制藥有限公司)、阿達帕林藥品(商品名為達芙文，法國高德美國際公司生產)，以上3種藥物10 ml內含所含成分為40 mg、20 mg、400 mg。細胞培養超凈臺(蘇州凈化)，培養箱(美國Queue systems)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，高轉速冷凍離心機(德國BiofugeStratos)，轉膜儀及電泳儀(美國伯樂公司)，PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)。

1.2細胞培養與傳代HaCaT細胞培養于含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養基中，置于5%CO2、37℃孵箱中傳代培養。當細胞密度達到4×106以上的時候進行傳代，清洗培養基后，用含0.02%EDTA的胰蛋白酶進行細胞消化，倒置顯微鏡觀察細胞回縮即終止消化，加入同體積的有血清培養基，吹打，10 000 r/min離心5 min，棄上清，取細胞懸液，計數后接種到新的培養瓶中。

1.3分組及加藥待細胞貼壁生長至4×106，分別予以不同濃度異維A酸、阿維A、阿達帕林(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)，不同作用時間(0、6、12、24、48 h)給藥刺激。

1.4免疫組化方法采用SP檢測法，切片脫蠟，加入3%過氧化氫封閉阻斷內源性過氧化物酶，50 μl非免疫動物血清封閉，加50 μlAQP3一抗過夜，50 μl生物素標記第二抗體，辣根過氧化物酶孵育，DBA顯色，蘇木素復染，中性樹膠固封。結果判定：陽性細胞為細胞胞質胞膜在倒置顯微鏡下出現深棕黃色的染色。

1.5半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法取HaCaT細胞定量100 mg，提取總RNA。取2 μg總RNA行逆轉錄cDNA，取20 μl作為反應體系。PCR反應由逆轉錄產物2 μl以及18 S RNA和AQP3的引物共同組成。反應過程按照標準的RT-PCR步驟進行：首先預變性的反應條件為95℃、5 min，接著進行梯度變性反應，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減，共進行30次的循環。接著對所得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過拍攝電泳圖像對所得到的電泳結果進行凝膠成像分析系統分析。內參選擇18 SRNA作為參照，同樣完成以上PCR系統的成像，對得到的半定量結果進行對比分析，通過量化的吸光度積分值進行分析(A值)。

1.6Western印跡方法取HaCaT細胞提取100 mg總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉膜，加AQP3一抗(1∶500)，4℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h。ECL光化學法顯色，用彩色圖像分析系統測定吸光度。

1.7統計學方法應用SPSS21.0統計軟件進行LSD檢驗。非參數檢驗Kruskal-wallisH檢驗及Mann-whitneyU檢驗。

2結果

2.1免疫組化法檢測AQP3表達未加藥刺激的HaCaT細胞AQP3主要在表皮基底層表達，且染色強度較弱。異維A酸、阿維A、阿達帕林刺激HaCaT細胞后AQP3幾乎在基底層到棘層的全部區域都有分布，且染色強度較強。見圖1。

圖1　免疫組化法檢測HaCaT細胞AQP3表達(DAB，×200)

2.2異維A酸、阿維A、阿達帕林對HaCaT細胞中AQP3 mRNA表達的影響不同濃度異維A酸、阿維A、阿達帕林作用24 h時，0.010 mg/ml濃度時，HaCaT細胞中AQP3 mRNA的表達值高于其他濃度表達值，組間比較差異(P<0.05)，見表1。HaCaT細胞在0.010 mg/ml異維A酸、阿維A、阿達帕林培養液中分別孵育6、12、24、48 h，結果顯示HaCaT細胞AQP3 mRNA 表達在6 h開始增加，在12 h達到峰值，AQP3 mRNA的表達異維A酸組>阿維A組>阿達帕林組，組間差異顯著(P<0.05)，見表2。HaCaT細胞在0.010 mg/ml異維A酸、阿維A、阿達帕林培養液中分別孵育6、12、24、48 h，結果顯示HaCaT細胞AQP3 mRNA 表達在6 h開始增加，在12 h達到峰值，AQP3 mRNA的表達異維A酸組>阿維A組>阿達帕林組，組間差異顯著(P<0.05)，見表2。

2.3異維A酸、阿維A、阿達帕林作用24 h對AQP3蛋白表達的影響不同濃度的異維A酸、阿維A、阿達帕林作用HaCaT細胞后的AQP3蛋白表達情況比較，濃度為0.010 mg/ml時，三組HaCaT中AQP3的表達均高于其他濃度，(P<0.05)，見表3。比較HaCaT在0.010 mg/ml異維A酸、阿維A、阿達帕林培養液中分別孵育6、12、24、48 h，結果顯示HaCaT中AQP3蛋白表達在6 h開始增加，在12 h達到峰值(P<0.05)，三組HaCaT中AQP3的表達異維A酸組>阿維A組>阿達帕林組，組間比較差異顯著(P<0.05)，見表4。

給藥濃度(mg/ml)異維A酸組阿維A組阿達帕林組0.0000.82±0.311)0.72±0.261)0.72±0.291)0.0011.12±0.561)1.10±0.291)1.03±0.331)0.0101.70±0.561.56±0.451.45±0.440.0601.16±0.691)1.22±0.361)1.05±0.421)0.1000.68±0.231)0.87±0.311)0.98±0.261)

與0.010 mg/ml濃度比較：1)P<0.05

給藥時間(h)異維A酸組阿維A組阿達帕林組00.79±0.281)0.70±0.241)0.66±0.251)61.10±0.541)1.08±0.271)1.01±0.311)121.45±0.561.31±0.431.31±0.42241.14±0.471)1.20±0.311)1.03±0.391)480.66±0.221)0.85±0.291)0.96±0.241)

與12 h組比較：1)P<0.05

給藥濃度(mg/ml)AQP3蛋白表達水平異維A酸組阿維A組阿達帕林組0.0001.39±0.561)1.72±0.861)1.76±0.861)0.0011.52±0.721)1.98±0.761)1.99±1.231)0.0103.23±1.992.56±1.862.45±1.220.0601.96±0.861)1.99±0.861)1.76±0.961)0.1001.23±0.731)1.59±0.851)1.69±0.951)

與0.010 mg/ml濃度比較：1)P<0.05

給藥時間(h)異維A酸組阿維A組阿達帕林組01.92±0.861)1.70±0.981)1.65±0.871)62.03±1.061)1.88±0.271)1.85±0.851)122.65±1.232.21±0.982.04±1.21241.96±1.021)1.86±0.851)1.86±0.891)481.66±0.961)1.84±0.811)1.65±0.731)

與12 h組比較：1)P<0.05

3討論

維甲酸是目前在皮膚科廣泛應用的一類藥物，具有多種的藥理活性，其可以通過抑制角質細胞的異常增殖和分化，同時促進正常的角質化進程〔8，9〕。另外該藥物還可以通過中性粒細胞的趨化作用記憶溶酶體的釋放作用，抑制皮脂腺的分化，具有抗炎作用，臨床上多用外用維甲酸類藥物治療痤瘡、抗角質化皮膚等，臨床上使用該藥物已取得了確切的療效〔10，11〕。但有一個不可回避的問題就是該類藥物的主要副作用可以導致皮膚黏膜的干燥，通常一般的補水方法很難緩解，很多患者都因為無法耐受藥物的副作用自行的停藥，終止治療。

水通道蛋白是幾年來不斷被人們認識的一類水特異性的膜蛋白，自從1988年發現AQP1以來，人們陸續發現了多種該類型的水通道蛋白，1994年發現了AQP3可對甘油等物質具有通透性，對水通道蛋白認識又更進了一步〔12，13〕。AQP3的高通透性，不僅僅可以運送水分還可以將內源性的甘油和皮脂腺中的甘油三酯帶到表皮中，從而參與表皮細胞的甘油代謝工作〔14〕。

研究發現通過維甲酸刺激后，AQP3的陽性細胞數、mRNA及蛋白表達均上調，這與皮膚的透皮失水的原理相同，AQP3表達上調，使皮膚屏障被破壞，細胞處于高滲的狀態，導致皮膚干燥等副作用的發生。同時我們還觀察到，隨著濃度的增加，達到一個峰值后AQP3表達又會隨之下調，可能的原因考慮與藥物的濃度過高以及作用時間過長有關，濃度的升高以及作用時間過長都會使得細胞內外藥物不能充分代謝，導致滲透壓的改變，當滲透壓過大的時候細胞的結構就會受到破壞，甚至會出現細胞膜的溶解，導致細胞的死亡〔15〕。從維甲酸的藥理作用及本研究結果上看，該藥不僅具有抗炎作用，同時還可以促進表皮細胞HaCaT中AQP3的表達，以發揮其修復皮膚黏膜屏障的功能〔16〕。因此在臨床的使用中應該把握好藥物的劑量及藥物的使用時間，不能一味追求高劑量和長期使用，以減少藥物的副作用，達到維持維甲酸的最佳治療效果。我們要做的是確保體內體外的調節一致性，由于我們所做的是體外實驗，并沒有考慮到體內的內環境對藥物的調節作用，藥物濃度的把握需要我們進一步驗證。

綜上所述，通過對角朊細胞的體外培養模型(HaCaT)AQP3 表達及甲酸類藥物干預作用的研究，我們認為AQP3的表達與藥物的干預的關系緊密，接下來需要進一步深入探討AQP3在體內實驗模擬疾病治療作用，可以進一步闡明該類藥物治療的作用機制與途徑，為臨床治療提供理論依據和治療方案。

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〔2013-12-09修回〕

(編輯曹夢園)